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钙振荡频率调节组胺诱导转录因子激活的机制研究

作　者: 宋珊珊
导　师: 胡清华
学　校: 华中科技大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 钙振荡受体刺激转录因子NF-κB 人气道上皮细胞
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胞浆游离钙离子([Ca²⁺]i)可作为重要的第二信使在细胞功能的调节上发挥着重要的作用。钙离子在调节细胞功能上具有多样性,包括细胞的黏附、位移、基因表达、增殖分化。然而,单一的钙离子是如何实现其功能的特异性呢?这是有关钙信号研究的热点话题。钙离子浓度升高可表现为多种形式:一过性钙离子浓度升高,持续性钙离子浓度升高,振荡形式的钙离子浓度升高。其中钙振荡（calcium oscillation）是胞内普遍存在的一种信息模式。钙振荡（calcium oscillation）在运动形式上表现为多参数:振幅、频率、持续时间等。1998年Lewis等人应用钙钳制技术证明了人工钙振荡频率的变化可特异性调节转录因子NF-κB、NF-AT、OCT/OAP的转录活性,并可提高钙离子的工作效率。1999年Hu利用XeC下调组胺诱导人主动脉内皮细胞钙振荡频率,首次证明了受体介导钙振荡频率可特异性调节转录因子NF-κB的活性。钙振荡的频率变化特异性调节细胞功能的观点已被广泛接受。然而,频率依赖性的机制是什么呢?经仔细观察发现,频率的变化在形式上表现为单位时间内胞浆钙离子浓度([Ca²⁺]i)升高与回落的次数的多少。高频钙振荡时,胞浆钙离子浓度([Ca²⁺]i)在单位时间内升高与回落的次数多,钙离子在某一浓度持续的累积时间长,低频钙振荡时与之相反。在生理或病理生理条件下,某些细胞或组织间断释放细胞因子（组胺等）,以旁分泌或自分泌的形式发挥作用,从而引起细胞钙信号的产生亦是间断性的。据此推测,钙振荡频率变化的本质与累积波宽（钙离子在某一浓度持续的累积时间）有关。在此,本项研究应用组胺间断刺激人气道上皮细胞16HBE产生钙振荡,建立振幅、频率相同而累积波宽不同和振幅、累积波宽相同而频率不同的钙振荡模型,并对下游转录因子NF-κB的活性进行测定。发现振幅、累积波宽相同而频率不同时,NF-κB的活性的活性相同;振幅、频率相同而累积波宽不同时,NF-κB的活性的活性亦不相同。由此证明了钙振荡频率调节受体介导激活转录的本质是累积波宽。目的本研究通过组胺间断刺激在人气道上皮细胞建立振幅、频率相同而累积波宽不同和振幅、累积波宽相同而频率不同的钙振荡模型,并对下游转录因子NF-κB的活性的进行检测,研究钙振荡频率调节下游生物学效应的内在机制。方法1.利用本实验室自行研制的全自动显微灌流控制系统使有组胺灌流液和无组胺灌液交替对细胞进行灌流,细胞标记有钙离子荧光指示剂Fura-2 ,在灌流的同时利用钙离子成像系统对钙离子浓度变化进行监测,建立钙振荡模型。2.利用本室自行研制的全自动显微灌流控制系统使有组胺灌流液和无组胺灌流液交替对细胞进行灌流,复制钙振荡模型。细胞经不同钙振荡处理后,用基于ELISA的转录因子活性检测方法检测NF-κB活性。结果1.在100秒（s）、200s、300s内用组胺浓度为10μmmol的灌流液分别作用于细胞20s、40s、60s,总灌流时间为45分钟（min）。三种钙振荡的振幅分别为（467.1±57.1）nmol/L（n=21）、（466.8±84.6）nmol/L（n=28）、（467.9±73.2）nnmol/L（n=38）,振幅无显著性差异（p>0.05）。频率分别为0.6次/分钟（min-1）、0.3（min-1）、0.2（min-1）。波宽分别为（18.1±1.6）s（n=13）、（36.0±3.0）s（n=17）、（54.6±2.5）s（n=17）。在45 min的灌流时间内,三种频率的钙振荡的累积波宽相同,均为486s;组胺刺激的总时间亦相同,均为540s。由此建立了振幅相同、累积波宽相同而频率不同的钙振荡模型。随后,改变灌流条件,在100s内用组胺浓度为10μmmol的灌流液作用于细胞30s,灌流液中钙离子的浓度依次为1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,总灌流时间为45 min。三种钙振荡的振幅分别为（466.7±58.6）nmol/L（n=29）、（465.3±52.8）nmol/L（n=31）、（466.8±84.5）nmol/L（n=28） ,振幅无显著性差异（p>0.05）。波宽分别为（15.3±1.9）（sn=18）、（20.4±4.1）（sn=24）、（29.6±4.7）（sn=28）,波宽的差别有统计学意义（p<0.05）。三种钙振荡的频率均为0.6 min-1。由此建立了振幅相同、频率相同而累积波宽不同的钙振荡模型。以同样的方式建立频率分别为0.3 min-1、0.2min-1振幅相同、频率相同而累积波宽不同的钙振荡模型。2.（1）振幅相同、累积波宽相同,频率不同的钙振荡对NF-κB活性的影:用含有10μmmol组胺的灌流液在100s、200s、300s内分别作用于细胞20s、40s、60s,总灌流时间为45 min。NF-κB的活性分别为（184.7±22.7）%、（157.8±9.1）%、（158.3±12.7）%,空白对照组的活性为100%,三种条件下与空白对照组相比,活性均有明显升高（p<0.05）,但三组之间活性无显著性差异（p>0.05）。（2）振幅相同、频率相同,累积波宽不同的钙振荡对NF-κB活性的影:用含有10μmmol组胺的灌流液在100s内作用于细胞30s,分别用钙离子浓度为1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三种不同的灌流液作用,总灌流时间为45 min。NF-κB的活性分别为（144.4±6.1）%、（209.1±22.2）%、（394.3±65.4）%,空白对照组的活性为100%,三种条件下与空白对照组相比,活性均有明显升高（p<0.05）,三组间的活性有显著性差别（p<0.05）。用含有10μmmol组胺的灌流液在200s内作用于细胞30s,分别用钙离子浓度为1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三种不同的灌流液作用,总灌流时间为45 min。NF-κB的活性分别为（126.7±12.2）%、（147.6±13.9）%、（198.6±26.3）%。空白对照组的活性为100%,三种条件下与空白对照组相比,活性均有明显升高（p<0.05）。其中1.0mmol组和1.5mmol组NF-κB活性的差别无统计学意义（p>0.05）;1.0mmol组和2.0mmol组NF-κB活性的差别有统计学意义（p<0.05）, 1.5mmol组和2.0mmol组NF-κB活性的差别有统计学意义（p<0.05）。用含有10μmmol组胺的灌流液在300s内作用于细胞30s,分别用钙离子浓度为1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol三种不同的灌流液作用,总灌流时间为45 min。NF-κB的活性分别为（111.4±7.0）%、（113.0±3.2）%、（119.6±9.8）% ,三种条件下与空白对照组相比,活性均有明显升高（p<0.05）。三组间两两比较NF-κB活性的差别无统计学意义（p>0.05）。组间对照用无组胺灌流液灌流细胞,钙离子浓度分别为1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol,三组间NF-κB的活性无显著性差异（p>0.05）。结论本实验在人气道上皮细胞中成功地建立了振幅、频率相同,累积波宽不同以及振幅、累积波宽相同,频率不同的钙振荡模型。为研究钙振荡如何调节NF-κB活性奠定了基础。钙振荡调节NF-κB的活性,在振幅、累积波宽相同,频率不同时,NF-κB的活性无明显差异;在振幅、频率相同,累积波宽不同时,NF-κB的活性有显著性差异。由此证明了钙振荡频率调节下游生物学效应的本质是累积波宽。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-14
前言  14-16
材料与方法  16-22
结果  22-34
讨论  34-37
参考文献  37-41
综述  41-49
  参考文献  46-49
致谢  49

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