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幼兔大肠杆菌LEE毒力岛的流行病学调查及兔腹泻病多重PCR诊断方法的建立

作　者: 杨少华
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 幼兔腹泻 LEE毒力岛多重PCR
分类号: S854.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

随着集约化养兔业的发展,家兔腹泻病也日益严重,特别是断奶前后幼兔的腹泻病发病率高死亡率高,造成了巨大的经济损失,从而严重制约着养兔业的发展。本研究在对20-80日龄腹泻幼兔进行细菌分离鉴定的基础上,重点对肠致病性大肠杆菌LEE毒力岛的流行病学进行了调查研究,从而为研究该病的发病机制和控制措施提供理论依据。同时还研究了一种利用多重PCR法同时鉴定大肠杆菌和魏氏梭菌的诊断方法,为快速准确诊断提供了基础。本研究共分三部分:第一部分:幼兔大肠杆菌病的调查研究本研究报告了断奶前后幼兔的大肠杆菌病的调查研究结果,并侧重于病原学方面。其主要内容包括流行病学、临床表现、病理形态学、病原形态及理化特征、药敏试验等,从中发现了一些规律和特点,填充了家兔大肠杆菌病的内容,对有效地诊断和防治家兔大肠杆菌病具有一定的指导意义。第二部分:从幼兔分离的大肠杆菌LEE毒力岛的流行病学调查对从潍坊、曲阜、恒台、烟台、莱芜、泰安等地兔场的断奶前后腹泻和健康兔肠内容物或粪便中分离的大肠埃希氏菌,用PCR法检测LEE毒力岛上的eaeA基因。结果发现,在20-30日龄、30-55日龄、55-80日龄的腹泻幼兔中,携带LEE毒力岛的大肠埃希氏菌检出率分别分00/5、72.7%24/33、23.5%4/17,而在相同日龄的健康幼兔中检出率为 00/24。结果说明eaeA阳性的肠致病性大肠杆菌EPEC应是导致上述兔场断奶后幼兔发生腹泻症的主要细菌性病原;LEE毒力岛的检测能够作为兔肠致病性大肠杆菌REPEC的诊断和流行病学调查的主要手段。第三部分:应用多重PCR同时扩增肠致病性大肠杆菌、魏氏梭菌的诊断基金项目:山东省2001年重点攻关项目“集约化养兔腹泻症病因学研究”,[ 012010116]<WP=8>方法的建立本研究建立了一种同时检测大肠杆菌和魏氏梭菌的二重PCR方法,根据REPEC的eae毒力基因和魏氏梭菌的α-toxin毒力基因的基因文库,设计了两对分别与eae和α-toxin某段基因互补的引物,用这两对引物对同一样品中的REPEC和魏氏梭菌模板进行二重PCR扩增。结果均得到了两条特异性大小与试验设计相符的833bpREPEC和324bp魏氏梭菌的扩增条带,而对其它3种病原菌的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该二重PCR技术能检出10cfu的REPEC,10cfu的魏氏梭菌。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
英文缩略表  12-13
引言  13-19
  1.1 断奶幼兔腹泻病研究现状  13-14
  1.2 兔肠致病性大肠杆菌性腹泻的研究情况  14-16
  1.3 魏氏梭菌的致病机理  16-17
  1.4 二重PCR诊断肠致病性大肠杆菌和魏氏梭茵  17-19
实验一断奶前后幼兔大肠杆菌病的调查研究  19-25
  1 材料  19
  2 方法  19-20
    2.1 临床症状及病理组织学  19
    2.2 病原分离与鉴定  19-20
      2.2.1 显微镜检查  19-20
      2.2.2 细菌分离培养  20
      2.2.3 生化实验  20
    2.3 药敏实验  20
  3 结果  20-23
    3.1 流行病学特点  20
    3.2 临床症状  20-21
    3.3 病理组织学变化  21
      3.3.1 音检病变  21
      3.3.2 组织学变化  21
    3.4 病原分离鉴定  21-23
      3.4.1 镜检结果  21
      3.4.2 细菌分离培养  21-23
      3.4.3 生化实验结果  23
    3.5 药敏实验结果  23
  4 讨论  23-25
实验二从幼兔分离的大肠杆菌LEE毒力岛的分子流行病学调查研究  25-31
  1 材料  25
  2 方法  25-26
    2.1 引物设计  25
    2.2 模板DNA的制备  25
    2.3 PCR检测  25-26
    2.4 PCR产物检测  26
    2.5 eae阳性菌株生理生化特性研究  26
  3 结果  26-28
    3.1 山东省不同地区的腹泻兔eaeA阳性大肠杆菌检出率  26
    3.2 不同曰龄的健康幼兔和腹泻幼兔eaeA阳性大肠杆菌及其它肠道致病菌检出率  26-27
    3.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果  27-28
    3.4 生化实验结果  28
  4 讨论  28-31
实验三应用多重PCR快速检测肠致病性大肠杆菌、魏氏梭菌  31-39
  1 材料  31-32
  2 方法  32-34
    2.1 引物设计  32
    2.2 模板DNA的制备  32-33
    2.3 普通PCR扩增反应  33-34
    2.4 多重PCR扩增反应  34
    2.5 敏感性试验  34
    2.6 特异性试验  34
    2.7 PCR产物的分析  34
      2.7.1 1%的琼脂糖凝胶电泳  34
      2.7.2 PCR扩增产物回收测序  34
  3 结果  34-36
    3.1 二重PCR反应条件的优化结果  34-35
    3.2 二重PCR扩增结果  35
    3.3 敏感性试验结果  35-36
    3.4 二重PCR特异性扩增结果  36
    3.5 MPCR产物回收测序结果  36
  4 讨论  36-39
结论  39-41
参考文献  41-53
附图  53-57
致谢  57-58
研究生期间发表论文  58

幼兔大肠杆菌LEE毒力岛的流行病学调查及兔腹泻病多重PCR诊断方法的建立

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