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新型高灵敏荧光试剂的合成及在高效液相色谱和电泳中的应用研究

作　者: 张琳
导　师: 尤进茂
学　校: 曲阜师范大学
专　业: 物理化学
关键词: HPLC Fluorescence detection Fluorescent reagents Derivatization reaction
分类号: TQ421.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

高效液相色谱是分析化学中发展最快，应用最广泛的领域之一，其分离特性使之成为临床化学、环境化学、生物学、毒物学等诸多领域中被广泛采用的有效分离和质量监控手段。由于化合物本身性质和检测手段的限制，并非所有物质都能够直接用于色谱分析，为此开发新型高灵敏衍生试剂，利用化学衍生化反应达到改变目标化合物的物理化学性质后，使之能够灵敏、快速和自动化测定是本文的研究目的。本文系统综述了液相色谱中所用的荧光检测器的荧光原理，介绍了近年发展的荧光试剂及它们的使用方法，制备了新型荧光标记试剂，对新型衍生化试剂的衍生化条件、色谱分离性能、灵敏度等方面进行了研究。尽管目前已发展出许多种荧光试剂，但在实际应用中都存在这样或那样的缺点，所以需要不断开发新型的高灵敏试剂来满足实际需要，我们以咔唑、吖啶酮为母体环分子，对其进行化学修饰，引入活性基团，合成了四种荧光衍生试剂(咔唑-9-乙基氯甲酸酯、9-(2-羟乙基)-吖啶酮、9-(2-羟乙基)-咔唑、吖啶酮-9-乙基氯甲酸酯)并将前两种其应用于HPLC(高效液相色谱)中。首次对咔唑-9-乙基氯甲酸酯、9-(2-羟乙基)-吖啶酮两种新型的高灵敏荧光试剂与氨基酸、胺类、及羧酸类化合物的衍生化反应及其衍生产物在高效液相色谱中的分离进行了系统的研究。选择了最佳流动相体系，对衍生化反应条件进行了优化，此外，还将这两种荧光试剂首次应用于饲料水解液中氨基酸、鸡蛋清水解液中氨基酸、多肽、海水中的胺类化合物和生物胺等复杂样品的分离，取得了较满意的结果。检测限达到了fmo1级的水平，线性范围较宽。采用254 nm紫外检测研究了9种CEOC衍生化氨基酸的胶束电动力学色谱(MEKC)分离特性，考察了胶束浓度。缓冲溶液pH值、硼酸缓冲液浓度和有机溶剂对迁移时间和分离选择性的影响，得到了优化的分离条件：缓冲溶液：20mmol／L硼酸盐-30mmol／L SDS，pH=9.0，曲阜师范大学硕士研究生学位论文乙腊含量3％（体积比），分离电压为ukV．为更多种类CBoC衍生化氨基酸的分离及荧光检测奠定了基础．新型标记试剂的合成： 1．9－（2－羟乙基）－叶吐（HBC）的制备：kX咋哇、淇乙酸乙酯和氢氧化钾为起始原料，在二甲亚现溶剂中保持95C搅拌反应1小时，反应物倾于氢氧化钾溶液中进行水解，水解液用酸中和即得粗品，9－（咋哇卜乙酸，再以 9－（咋哇卜乙酸为起始原料在乙醚中用氢化枢铝还原得9－（2－羟乙基卜十哇，在正己烷中重结晶得白色针状晶体． 2．9－（卜羟乙基卜叶唆酮（肥A）的制备：以卜苯基邻胺基苯甲酸为起始原料，在浓硫酸的缩合下得”（吱酮粗品，粗品在苯胺和冰醋酸的混合溶剂中重结晶得纯品．在N，N’－二甲甲基甲酞胺（D回F）溶液中，。丫唆酮和碳酸亚乙酯在痕量氢氧化钾的存在下，加热沸腾反应一小时，得卜Q－羟乙基卜。丫唆酮粗品．所得粗品在热的苯溶液中重结晶两次获得浅黄色针状晶体． 3．咋哇刁－乙基氯甲酸酯（EOC）的制备：FX 9、2－羟乙基卜叶吐。为原料，在无水二氯甲烷中与固体光气在有机碱催化剂的存在下，保持0“C以下电磁搅拌4J、时，馒馒将反应液的温度升至室温保持6小时，反应完毕，用旋转蒸发仪将溶剂蒸出，得到白色固体样品在乙醚和二氯甲烷按（3：1）的混合溶剂重结晶，产品为白色针状晶体． 4．P’（咬酮刁－乙基氯甲酸酯（ABOC）的制备：kX 9－u－羟乙基）－叮唆酮为原料，在苯和二氟甲烷的混合溶剂中与固体光气在有机碱催化剂的存在下在保持0叩以下电磁搅拌4J、时，馒将反应液的温度升至5 0忙保持6小时，反应完毕，用旋转蒸发仪将溶剂蒸出，得到黄色固体样品．在乙醚与二氯甲烷按（1：1）的混合溶剂中重结晶．实践证明，与现存的一些荧光试剂相比，这两种新型的高灵敏荧光衍生试剂与胺类、氨基酸及欺酸类化合物的衍生化反应条件温和；简单易操作；衍生反应产率高；衍生产物的性质穗定，易于分离；反应副产物不影响被分析物的分离测定，具有很好应用价值．

新型高灵敏荧光试剂的合成及在高效液相色谱和电泳中的应用研究

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