学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

抗恶性疟原虫HRP-II单链抗体库的构建、筛选

作　者: 侯云霞
导　师: 董文其
学　校: 第一军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 噬菌体抗体库单链抗体富含组氨酸蛋白Ⅱ（HRP－Ⅱ）
分类号: R392-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 95次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

疟疾（malaria）是广泛流行于热带、亚热带甚至温带边缘的一种重要虫媒传染病，严重地威胁着人类的健康。疟疾疫情虽然曾得到较好的控制，但近几年又有回升趋势，切实可行的预防、诊断、治疗工作迫在眉睫。噬菌体抗体库技术为基因工程抗体的研究开辟了新的领域，各种小分子抗体（特别是人源性小分子抗体）应运而生，并在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗（细胞内免疫）等多个领域展示出巨大的潜能和广阔的应用前景。该技术与传统的杂交瘤技术制备抗体相比，具有简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵大量制备且可绕过细胞杂交（甚至可不经过免疫）等优点。本研究采用噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术，用HRP-Ⅱ-β半乳糖苷酶融合蛋白免疫小鼠，取其脾细胞提取mRNA，经逆转录PCR扩增出抗体重链和轻链可变区基因库，大小分别为340bp和300bP左右，纯化回收的V_H与V_L在接近等摩尔浓度下，用重叠延伸拼接法以Linker相连组装成单链抗体基因（ScFv），再用带限制性内切酶位点的引物（5’端SfiⅠ，3’端NotⅠ）扩增ScFv基因片段，获得大小约750bp的目的片段，纯化后分别用SfiⅠ和NotⅠ消化，与SfiⅠ/NotⅠ双酶切的载体pCANTAB5E连接，化学法转化大肠杆菌TG1感受态细胞，转化率为3.3×10~6/μgDNA。转化菌经辅助噬菌体M13K07援救后，得到库容约为1.2×10~6的中等大小的噬菌体抗体库。经质粒和PCR初步鉴定，证明有外源片段插入且其大小与目的片段一致，连接率为60％。在成功构建抗HRP-Ⅱ噬菌体抗体库的基础上，我们以HRP-Ⅱ为靶抗原对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附-扩增-援救”的富集过程，从而得到了抗HRP-Ⅱ的次级噬菌体抗体库（滴度为4.2×10~8cfu/ml）。用富集后的库液铺板并挑取单菌落制备噬菌体抗体，分别用HRP-Ⅱ-β半乳糖苦酶融合蛋白和β-半乳糖苷酶筛选，以单纯抗HRP-Ⅱ-β半乳糖苷第一军医大学硕士学位论文酶融合蛋白阳性的克隆为抗HRP－11的阳性克隆，共得到8个阳性克隆株。选阳性反应较强的95号和63号菌株进行抗体的可溶性诱导表达并作进一步的鉴定，所表达的单链抗体分子量大小约为30kD左右，能与重组HRP－11抗原起特异性免疫反应，以培养上清中的抗体活性为最佳。通过对诱导表达条件的优化，发现以 OD。；，；；＝0．8、IPTG终浓度 0．2 mM、诱导温度30＊、诱导时间20小时为最优化条件。以最优化条件摇瓶培养1000 ml制备目的抗体，超滤浓缩后用饱和硫酸铰分步沉淀法（50％， 70％）加阴离子交换柱分离纯化目的抗体，获得浓度为 0．93ms／L，纯度为42．8％的抗 HRP－11单链抗体。测序结果表明插入片段完全，SJV为 749hp，与理论值相符，DNA及氨基酸序列同源性比较结果表明，该序列属于鼠源抗体SCFV序列，其人及V。分别属于鼠重链可变区第1亚群及K链第IV亚群。上述结果表明，用噬菌体抗体库技术制备单链抗体简便、高效，所获抗HRP－11单链抗体能与靶抗原起特异性免疫反应，具有作为免疫诊断试剂的潜质，为基因工程抗体的广泛应用奠定了基础。

全文目录

英文缩写  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-15
材料和方法  15-32
  一、主要材料和试剂  15-17
  二、方法  17-32
    （一）抗恶性疟原虫HRP-Ⅱ噬菌体单链抗体库的构建  17-25
      1．动物免疫  17-18
      2．脾细胞的获取  18
      3．总RNA的提取  18
      4． mRNA的纯化  18-19
      5． RT-PCR法扩增V_H及V_L片段  19-20
      6． ScFv基因的组装及扩增  20-21
      7． ScFv基因的连接转化  21-24
      8．噬菌体单链抗体库的构建  24
      9．噬菌体单链抗体库滴度的测定  24
      10．菌落筛选  24-25
      11．重组噬菌粒的PCR鉴定  25
    （二）特异性抗HRP-Ⅱ阳性克隆的筛选与鉴定  25-30
      1．抗HRP-Ⅱ噬菌体单链抗体库的富集与淘选  25-26
      2．抗HRP-Ⅱ阳性克隆的筛选  26-27
      3．可溶性单链抗体的制备  27-28
      4．可溶性单链抗体的鉴定  28-29
      5．单链抗体基因的序列分析  29-30
    （三）抗HRP-Ⅱ可溶性单链抗体表达条件的优化  30
      1．诱导温度的优化  30
      2．诱导时相的优化  30
      3．诱导时间的优化  30
      4．诱导剂浓度的优化  30
    （四）可溶性单链抗体的大量制备和纯化  30-32
      1．可溶性单链抗体的大量制备  30-31
      2．饱和硫酸铵沉淀法初步纯化抗体  31
      3．阴离子交换柱纯化抗体  31-32
结果  32-48
  一、抗恶性疟原虫HRP-Ⅱ噬菌体单链抗体库的构建  32-35
    （一） RNA的提取及mRNA的纯化  32
    （二） V_H和V_L基因片段的扩增及鉴定  32
    （三） ScFv基因的组装及扩增  32-33
    （四） ScFv基因的克隆转化  33
    （五）噬菌体抗体库滴度的测定  33
    （六）菌落筛选  33-34
    （七）重组噬菌粒的PCR鉴定  34-35
  二、特异性抗HRP-Ⅱ阳性克隆的筛选与鉴定  35-42
    （一）抗HRP-Ⅱ噬菌体单链抗体库的富集与淘选  35
    （二）抗HRP-Ⅱ阳性克隆的筛选  35-42
      1．重组噬菌粒的双酶切鉴定  35-36
      2．抗HRP-Ⅱ噬菌体单链抗体的免疫活性鉴定  36
      3．抗HRP-Ⅱ可溶性单链抗体的鉴定  36-38
      4．阳性克隆核酸序列分析结果  38-42
  三、抗HRP-Ⅱ可溶性单链抗体表达条件的优化  42-44
    （一）诱导温度的优化  42
    （二）诱导时相的优化  42-43
    （三）诱导时间的优化  43-44
    （四）诱导剂浓度的优化  44
  四、可溶性抗HRP-Ⅱ单链抗体的大量制备与纯化  44-48
讨论  48-55
小结  55-56
参考文献  56-63
致谢  63-64
综述一  64-68
综述二  68-75
附录  75

抗恶性疟原虫HRP-II单链抗体库的构建、筛选

内容摘要

全文目录

相似论文