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体外测定生物材料诱导成骨活性方法的建立和应用

作　者: 姜传杰
导　师: 亓建洪；卢世璧；孙明学；袁玫；朱宝林
学　校: 泰山医学院
专　业: 外科学
关键词: 诱导成骨活性生物材料碱性磷酸酶骨钙素
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

大段骨缺损、脊柱融合、骨肿瘤、重建外科等都需要大量的骨移植材料。自体骨移植提供的骨量往往难以满足需要,近年来具有诱导成骨或传导成骨活性的生物材料得到越来越多的使用。具有诱导成骨活性的生物材料如脱钙骨基质、内源性骨蛋白复合材料、重组生长因子复合生物材料,其应用效果取决于其中所含生长因子的活性。但是制备、贮存、消毒等环节可以使其失活,为保证生物活性材料的有效使用对生物材料进行活性测定是非常有必要的。传统的动物体内测定活性的方法有许多缺点,如需要牺牲动物、测定周期长、影响因素多、难以标准化和程序化、费用高等缺点,难以满足实际需要。本文研究拟建立一套简便可行,可进行标准化操作,重复性好,成本低的体外测定生物活性材料的标准化方法,以作为传统动物体内检测方法的替代方法,并尝试对数种常用生物活性材料的成骨活性进行测定并比较。目的：本文研究拟建立一套简便可行,可进行标准化操作,重复性好,成本低的体外测定生物材料诱导成骨活性的标准化方法,以作为传统动物体内检测方法的替代方法,并尝试对数种常用生物活性材料的诱导成骨性能进行测定并比较。方法：第一部分：生物材料诱导成骨活性体外测定方法的建立。制备山羊脱钙骨基质(Demineralized Bone Matrix DBM)做免疫组化检查其是否含有BMP-2。并取DBM(A组)、rhBMP-2(B组)、牛腱Ⅰ型胶原(C组)三种材料与C2C12细胞共培养72小时后,用1%Triton-X100裂解细胞,取细胞裂解液测定碱性磷酸酶(Alkaline PhosphataseALP)和蛋白含量。利用所测定的碱性磷酸酶和蛋白吸光度的比值代表单位数量细胞中所含ALP的含量。另取培养孔中培养液通过放射免疫的方法测定骨钙素(Bone GlaProteinBGP)的含量。第二部分：体外生物材料成骨活性测定方法的应用。利用已建立的体外测定方法对山羊DBM、OsteoSet(?)、人DBM、牛腱Ⅰ型胶原的诱导成骨活性进行测定和比较其活性。结果：第一部分：免疫组织化学测定结果显示DBM中BMP-2染色阳性。用DBM和rhBMP-2刺激C2C12细胞后,细胞中ALP的含量和培养液中骨钙素的含量较对照组(单纯细胞组)明显增高。rhBMP-2组C2C12细胞产生的ALP含量和骨钙素较DBM明显增高。BGP的测定结果与ALP呈高度直线相关,相关系数为0.877(p<0.01)。第二部分：在山羊DBM组、人DBM组两组中,被测材料明显促进C2C12细胞产生碱性磷酸酶,与对照组相比差异有显著性(P<0.001),二者的均数分别为1.668、1.108,两组差异有显著性。OsteoSet(?)和胶原对于C2C12细胞碱性磷酸酶代谢无明显影响(P>0.05),其均数分别为0.483、0.446。BGP的测定结果与ALP平行。结论：1、rhBMP-2能够刺激C2C12细胞持续高表达ALP和BGP,同样具有诱导成骨活性的其它生物材料也能够刺激C2C12产生成骨细胞特异性标记物---碱性磷酸酶和骨钙素。对照组其ALP活性明显低于rhBMP-2及DBM组,说明该种方法对判定生物材料的诱导成骨活性准确可行。2、利用已建立的体外测定方法可以同期测定多种材料诱导成骨性能,利用量化指标可以对多种生物材料的成骨性能进行比较。实验结果表明：山羊DBM、OsteoSet(?)、人DBM、Ⅰ型胶原的诱导成骨活性存在明显差异,山羊DBM的诱导成骨活性较人的DBM更高,OsteoSet(?)和牛腱Ⅰ型胶原无诱导成骨活性。3、体外测定生物材料成骨活性的方法可以对生物材料的诱导成骨活性进行有效评估,能够批量检测,量化指标便于材料间活性的比较。其方法简便准确,可进行标准化操作,重复性好,成本低,可以作为传统动物体内检测方法的替代方法。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
符号说明  9-10
前言  10-12
第一部分体外测定生物材料诱导成骨活性方法的建立  12-29
  材料与方法  12-16
  结果  16-18
  讨论  18-25
  小结  25-26
  第一部分附图  26-29
第二部分体外测定生物材料诱导成骨活性方法的应用  29-36
  材料与方法  29
  结果  29-31
  讨论  31-34
  小结  34-35
  结论  35-36
参考文献  36-41
综述:生物材料诱导成骨活性检测方法  41-52
  参考文献  49-52
致谢  52-53

体外测定生物材料诱导成骨活性方法的建立和应用

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