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蛋白质的液相色谱复性研究及液固界面上蛋白折叠自由能的测定

作　者: 薛卫华
导　师: 耿信笃
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 液相色谱 蛋白质 变性 复性 动力学 折叠自由能 能垒 能阱
分类号: O629.73
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


全文分为三个部分。1. 疏水色谱法对?-淀粉酶及?-糜蛋白酶的脲变动力学研究用高效疏水色谱（HPHIC）对8.0 mol/L脲变性的?-淀粉酶(?-Amy)和?-糜蛋白酶(?-Chy)的变性动力学进行了研究，发现两者的变性动力学行为不同。?-Amy的变性为平缓的渐变过程,其中间体数目较多，且绝大多数中间体的疏水性都小于天然蛋白；而?-Chy则是骤变（可能是瞬间变性）过程,相对而言?-Chy的中间体数目较少，且疏水性大多大于天然蛋白。两种蛋白不同的脲变动力学行为可能是因蛋白中?-螺旋含量以及蛋白质自身稳定性不同所致。2. 蛋白质的液相色谱复性研究了?-Chy在HPHIC、离子交换色谱(IEC)、排阻色谱(SEC)上的复性情况，发现?-Chy之所以用色谱法复性效果不佳，主要是因为它在流动相中活性损失太大以及色谱柱对?-Chy的不可逆吸附所致。流动相的离子强度越高，?-Chy活性损失越大。经扣除流动相效应和固定相对?-Chy不可逆吸附后，发现疏水色谱和排阻色谱固定相对该蛋白的复性有积极的贡献，离子交换色谱固定相的复性作用不明显。疏水色谱对?-Chy的复性能力与色谱柱疏水性强弱有关。此外还发现SEC对变性?-Chy的复性效果明显较透析法好，复性的最佳流动相盐浓度处于0.05-0.5 mol/L之间。3. 液固界面上蛋白折叠自由能的测定依据蛋白在液固界面上折叠自由能的测定原理和方法，测定了脲体系中四种蛋白和盐酸胍体系中两种蛋白在疏水色谱固定相界面上的折叠自由能。两次平行测定的lgI值最大相对平均偏差不超过4.30%，表明实验结果具有良好的重现性，测定方法准确可靠。测得蛋白在疏水界面上的折叠自由能值高于文献报道的蛋白在溶液中的折叠自由能，并且随变性剂浓度的增大而增大。通过蛋白折叠自由能??GF对变性剂浓度作图，发现脲体系中?-淀粉酶和?-糜蛋白酶在折叠途径中均<WP=3>存在能阱；盐酸胍体系中，?-淀粉酶和?-糜蛋白酶在折叠途径中分别存在能垒和能阱。进一步证实了在某些蛋白的折叠途径中的确存在能垒或能阱。

全文目录


第一章 前言  8-15
  1．1 蛋白质的液相色谱复性  8-12
    1．1．1 蛋白质的变性  8-9
    1．1．2 蛋白质的复性  9-12
  1．2 折叠机理  12-13
  1．3 折叠自由能的测定  13-15
第二章 实验部分  15-21
  2．1 仪器  15
  2．2 试剂  15
  2．3 α-糜蛋白酶在HPHIC、IEC、SEC体系中的复性行为比较  15-16
  2．4 排阻色谱中影响胍变和脲变α-糜蛋白酶复性的因素  16-17
  2．5 疏水色谱法对α-淀粉酶及α-糜蛋白酶的脲变动力学研究  17
  2．6 蛋白质折叠自由能的测定  17-21
第三章 理论部分  21-25
  3．1 计量置换保留模型  21-22
  3．2 液固界面上蛋白折叠自由能测定的理论基础  22-25
第四章 疏水色谱法对α-淀粉酶及α-糜蛋白酶的脲变动力学研究  25-29
  4．1 α-淀粉酶的脲变动力学行为  25-26
  4．2 α-糜蛋白酶的脲变动力学行为  26-27
  4．3 α-淀粉酶和α-糜蛋白酶变性动力学行为之比较  27-28
  4．4 结论  28-29
第五章 蛋白质的液相色谱复性  29-43
  5．1 α糜蛋白酶在HPHIC、IEC、SEC体系中的复性行为比较  29-38
    5．1．1 脲变α-糜蛋白酶在HPHIC、IEC、SEC上的色谱行为  29-31
    5．1．2 复性效率比较  31
    5．1．3 流动相的影响  31-33
    5. 1. 4 固定相的影响  33-38
  5．2 排阻色谱中影响胍变和脲变α-糜蛋白酶复性的因素  38-42
    5．2．1 胍变和脲变α-糜蛋白酶的SEC复性色谱图  38-39
    5．2．2 胍变和脲变α-糜蛋白酶的SEC复性与透析法比较  39
    5．2．3 流动相中盐浓度对复性的影响  39-41
    5．2．4 流动相的盐种类对复性的影响  41-42
  5．3 结论  42-43
第六章 蛋白质折叠自由能的测定  43-60
  6．1 变性剂对色谱柱性能的影响  43-44
  6．2 不同浓度变性剂存在下的lgI和Z值  44-52
    6．2．1 脲体系中的lgI和Z值  44-46
    6．2．2 盐酸胍体系中的lgI和Z值  46-52
  6．3 液固界面上蛋白折叠自由能的测定  52-54
  6．4 蛋白折叠途径中能垒与能阱的确认  54-58
    6．4．1 能垒和能阱的定义  54-58
    6．4．2 蛋白折叠途径中的能量表征  58
  6．5 讨论  58-59
  6．6 结论  59-60
参考文献  60-62
致谢  62-63

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 有机化学 > 天然化合物 > α-氨基酸、肽类、蛋白质、核酸 > 蛋白质
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