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小麦大粒突变体的遗传分析和相关基因片段的克隆

作　者: 汪俊君
导　师: 李斯深
学　校: 山东农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 小麦 EMS 突变体 EST-SSR SSR SSH
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 42次
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内容摘要

传统的化学诱变方法,能诱发产生高密度的点突变,获得遗传背景相似的突变体。不仅能够解决小麦育种中种质资源匮乏的问题,也为相关基因的精细定位、克隆以及基因功能的分析等提供了基础材料。本研究采用EMS诱变小麦品种烟农15获得的大粒、高杆突变体8008为研究材料,对发生突变的粒长、粒宽和千粒重等性状进行遗传分析,尝试对突变基因进行初步定位及基因片段的克隆,为从分子水平上揭示小麦粒重遗传机制奠定基础。(1)大粒、高秆突变体8008与受体烟农15杂交,构建遗传分析群体。通过对杂种F2代和F3代群体的表型分析发现,高千粒重与低千粒重、宽粒与窄粒、高杆和矮杆这三对性状在F2群体中均呈3:1的分离比例,并且经卡方检验差异极显著,均为显性单基因控制;相关性分析表明,粒宽与粒重、粒长与粒重、高杆与粒重之间均为极显著相关。(2)用突变体8008和烟农15对860对SSR 的学位论文">EST-SSR引物和960对SSR引物进行筛选,所得差异引物在F2群体中选株进行二次筛选,共获得59对引物在群体中能扩增出99条差异条带。这59对引物共分布在16条染色体上,以B染色体组上分布位点最多,共27个;在16条染色体中,1B、2B、7B三条染色体上分布的位点最多,分别有7个、6个、6个。(3)以突变体8008和受体烟农15分别做为试验方和驱动方,利用抑制消减杂交技术(SSH),构建双向差减文库。在双向库中随机挑取阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行生物信息学分析。共获得12条EST与已知功能基因高度同源,主要包括:与光合作用相关的基因如RuBP羧化酶、光敏色素、叶绿素等;与物质代谢作用相关的基因如半胱氨酸水解酶、半胱氨酸蛋白酶、果糖基转移酶、蔗糖合酶I等;与RNA功能相关的基因如RNA结合蛋白、核糖蛋白体等。5条EST序列与未知功能的禾本科作物cDNA片段高度同源,7条EST未能找到同源性匹配。

全文目录

缩略词  3-7
摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
1 引言  10-26
  1.1 人工诱变产生突变体  11-14
    1.1.1 EMS 诱变机制  11
    1.1.2 EMS 诱变的特点  11-12
    1.1.3 EMS 诱变的应用  12-13
    1.1.4 突变体库的构建与应用  13-14
  1.2 图位克隆  14-19
    1.2.1 图位克隆的技术环节  15-17
    1.2.2 图位克隆的应用  17-18
    1.2.3 图位克隆应用的局限性  18-19
  1.3 抑制消减杂交技术  19-25
    1.3.1 抑制消减杂交技术（SSH）原理和特点  19-20
    1.3.2 抑制性差减杂交（SSH）技术的基本步骤  20-22
    1.3.3 抑制消减杂交（SSH）在植物中的应用  22-25
  1.4 本研究意义、研究内容、预期目标  25-26
2 材料与方法  26-43
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 PCR 引物  26-27
  2.2 实验方法  27-31
    2.2.1 农艺性状调查  27
    2.2.2 突变体的遗传分析  27
    2.2.3 突变体的分子标记分析  27-31
  2.3 抑制消减杂交（SSH）  31-40
    2.3.1 植物材料  31
    2.3.2 SSH 用试剂耗材  31-32
    2.3.3 总RNA 抽提  32-33
    2.3.4 RNA 纯化及质量检测  33
    2.3.5 mRNA 分离纯化  33-34
    2.3.6 cDNA 反转录  34-35
    2.3.7 cDNA RsaI 酶切  35-36
    2.3.8 接头连接  36-37
    2.3.9 差减杂交  37-38
    2.3.10 二轮差减PCR 鉴定  38-40
  2.4 差异片段的克隆  40-43
    2.4.1 差减PCR 扩增产物纯化  40
    2.4.2 差异片段的连接  40-41
    2.4.3 转化  41-42
    2.4.4 测序及同源性比较  42-43
3 结果与分析  43-57
  3.1 突变性状的遗传分析  43-45
  3.2 分子标记分析  45-47
  3.3 大粒突变体的SSH 分析  47-57
    3.3.1 总RNA 的提取和纯化  47-48
    3.3.2 逆转录及Rsa I 酶切结果检测  48-49
    3.3.3 二次PCR 后的消减杂交产物检测  49
    3.3.4 差异表达基因的克隆与EST 序列分析  49-57
4. 讨论  57-61
  4.1 EMS 诱变获得大粒突变体  57-58
  4.2 粒重相关基因的定位  58-59
  4.3 SSH 的应用  59-61
结论  61-62
参考文献  62-72
致谢  72-73
攻读学位期间发论文表情况  73

小麦大粒突变体的遗传分析和相关基因片段的克隆

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