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产β-半乳糖苷酶的节杆菌突变株筛选、发酵条件优化与酶基因保守序列分析

作　者: 董晓璇
导　师: 唐蕾
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: β-半乳糖苷酶复合诱变响应面法保守区域PCR扩增
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)是一种能够同时催化水解反应和转苷反应的酶,它可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖；半乳糖在其转苷酶活的作用下,与果糖作用生产乳果糖。β-半乳糖苷酶本身的酶学性质决定了其可以广泛应用于乳糖的降解(如水解乳制品中的乳糖以解决乳糖不耐症等)和功能性低聚糖的生产(如乳果糖、低聚半乳糖等)。本实验室从土壤中筛选得到一株节杆菌Arthrobacter sp.,其β-半乳糖苷酶同时具有水解与转苷两种酶活性。本文从如下4个方面对该菌株进行了进一步研究：为了提高菌株产β-半乳糖苷酶能力,首先利用亚硝基胍-氯化锂复合诱变,再利用紫外线-氯化锂复合诱变,筛选出一株诱变菌Arthrobacter sp. U14,经过实验证明该菌株β-半乳糖苷酶对底物ONPG的酶活达到2.65 U/mL,比出发菌株酶活0.465 U/mL提高470%。由于节杆菌Arthrobacter sp.所产β-半乳糖苷酶为胞内酶,所以在筛选β-半乳糖苷酶活性提高的菌株的过程中,建立了一种溶菌酶与SDS复合处理裂解细胞,细胞裂解液与X-gal反应显色进行高产菌筛选的方法。溶菌酶终浓度4mg/mL,37℃水浴1.5 h,再加入SDS终浓度1%,37℃水浴20 min。通过该方法可以有效缩小高产菌株的筛选范围,减少工作量,缩短工作时间,同时保持较高的筛选准确度。以菌株Arthrobacter sp.的乳糖培养基为基础,采用响应面法,对影响Arthrobacter sp.U14产β-半乳糖苷酶活性的发酵培养基成分进行考察和评价。优化后发酵条件：在自然pH值条件下,当乳糖浓度为5.4%,酵母抽提物浓度5.1%,Fe3+浓度0.93 mM时,β-半乳糖苷酶理论预测最大酶活为3.7 U/mL。优化后实际测定平均酶活为3.85 U/mL。比优化前酶活提高45.3%。根据已公开发表的节杆菌β-半乳糖苷酶保守区域序列设计引物,对Arthrobacter sp.与Arthrobacter sp. U14进行PCR扩增,得到600 bp长度的β-半乳糖苷酶保守区域的序列。利用DNAMAN软件对克隆出的基因序列进行比对,发现Arthrobacter sp.与Arthrobacter sp. U14在这一段保守区域核苷酸序列上的相似性为97.37%。

产β-半乳糖苷酶的节杆菌突变株筛选、发酵条件优化与酶基因保守序列分析

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