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棉布为载体金属螯合亲和膜的制备及性能研究

作　者: 李美
导　师: 杨严俊
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 亲和膜棉布蛋清蛋白乳清蛋白
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

固定金属螯合亲和膜是一种有效的蛋白质分离纯化技术。本文主要研究了棉布作为亲和膜基质的可行性,采用环氧活化法对棉布进行改性,制备Cu2+-IDA金属螯合亲和膜,对其制备工艺、蛋白质吸附性能及对蛋白质的分离纯化进行了研究,结果表明棉布作为膜载体具有一定的研究价值。通过对不同棉含量的布进行比较确定了以100%纯棉布作为亲和膜的载体,它具有较好的储藏稳定性,溶剂适用范围较广,可以保存在20%乙醇、空气和去离子水中三个月,铜结合量基本不变。通过重复实验,结果表明膜具有较好的重复使用性能。通过单因素和正交试验得出最佳的活化反应和偶联反应条件。活化反应最佳条件:活化温度为30℃,NaOH浓度为2.0mol/L,活化时间为4h,振荡频率为155r/min;偶联反应最佳条件:IDA用量为1.2g,偶联温度为50℃,偶联时间为10h。用此膜介质吸附溶菌酶时,1h左右达到吸附平衡;随着温度的升高,溶菌酶吸附量增加;离子强度的影响恰好相反,在低离子强度下,吸附量大,高离子强度下,吸附量下降。最佳pH为7.0时既可达到最佳吸附量又可防止蛋白质变性。亲和膜介质对溶菌酶的等温吸附线很好的符合Langmuir形式,经曲线拟合可知最大吸附容量Qm为0.50mg/cm2亲和膜。以棉布为载体制备亲和膜柱,确定了用此柱进行蛋白质分离纯化时的上样、淋洗、吸脱速度,分别为:0.8mL/min、1.6mL/min、2.0mL/min。在此条件下,选用蛋清蛋白和乳清蛋白这两个天然多蛋白体系对以纯棉布为载体制备的固定金属螯合亲和膜的性能进行了研究,研究表明:采用此种亲和膜一步分离纯化蛋清蛋白可以得到纯度较高的溶菌酶,分离纯化乳清蛋白的效果不是特别明显,吸附的蛋白质可能是乳清蛋白中含有的微量的酪蛋白。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-14
  1.1 亲和膜研究进展  8-12
    1.1.1 固定化金属螯合亲和色谱原理  8-9
    1.1.2 金属配位理论  9
    1.1.3 固定金属离子吸附蛋白质理论  9-10
      1.1.3.1 作用机理  9-10
      1.1.3.2 金属离子与氨基酸、蛋白质的相互作用  10
    1.1.4 亲和膜基膜材料  10-11
    1.1.5 亲和膜组件  11
    1.1.6 亲和膜应用前景  11-12
      1.1.6.1 蛋白和酶体系的分离  11
      1.1.6.2 基因工程蛋白的分离和纯化  11
      1.1.6.3 蛋白质的识别和鉴定  11-12
  1.2 功能性蛋白质介绍  12-13
    1.2.1 蛋清蛋白简介  12
    1.2.2 乳清蛋白简介  12-13
  1.3 立题背景及意义  13
  1.4 本课题的研究内容  13-14
第二章亲和膜的制备方法及载体的选择  14-20
  2.1 引言  14
  2.2 实验材料与设备  14-15
    2.2.1 实验材料  14
    2.2.2 实验设备  14-15
  2.3 实验方法  15-16
    2.3.1 亲和膜的制备方法  15
    2.3.2 环氧基密度测定  15
    2.3.3 Cu~(2+)－EDTA 最大吸收波长的确定及标准曲线的绘制  15
    2.3.4 回收率实验  15
    2.3.5 膜的储存稳定性  15
    2.3.6 蛋白质吸附量的测定  15-16
  2.4 结果与讨论  16-19
    2.4.1 铜离子测定方法的确定  16-17
      2.4.1.1 Cu~(2+)－EDTA 最大吸收波长的确定  16
      2.4.1.2 Cu~(2+)－EDTA 标准曲线的绘制  16-17
      2.4.1.3 回收率实验  17
    2.4.2 载体的确定  17-18
    2.4.3 亲和膜的储存稳定性  18-19
    2.4.4 膜柱重复利用性能的研究  19
    2.4.5 铜离子泄漏问题  19
  2.5 本章小结  19-20
第三章亲和膜的制备工艺条件的研究  20-28
  3.1 引言  20
  3.2 实验材料与设备  20-21
    3.2.1 实验材料  20
    3.2.2 实验设备  20-21
  3.3 实验方法  21-22
    3.3.1 亲和膜的制备  21
    3.3.2 纯棉布为膜材料活化反应条件的确定  21
      3.3.2.1 温度对活化反应的影响  21
      3.3.2.2 碱浓度对活化反应的影响  21
      3.3.2.3 活化时间对活化反应的影响  21
      3.3.2.4 振荡频率对活化反应的影响  21
      3.3.2.5 溶胀时间对活化反应的影响  21
    3.3.3 纯棉布为膜材料配基偶联反应条件的确定  21-22
      3.3.3.1 IDA 用量对偶联反应的影响  21-22
      3.3.3.2 温度对偶联反应的影响  22
      3.3.3.3 时间对偶联反应的影响  22
    3.3.4 环氧基含量的测定  22
    3.3.5 铜离子含量的测定  22
  3.4 结果与讨论  22-27
    3.4.1 活化反应条件的确定  22-24
      3.4.1.1 温度对活化反应的影响  22
      3.4.1.2 碱浓度对活化反应的影响  22-23
      3.4.1.3 活化时间对活化反应的影响  23
      3.4.1.4 振荡频率对活化反应的影响  23-24
      3.4.1.5 溶胀时间对活化反应的影响  24
    3.4.2 配基偶联反应条件的确定  24-26
      3.4.2.1 IDA 用量对偶联反应的影响  24-25
      3.4.2.2 温度对偶联反应的影响  25
      3.4.2.3 时间对偶联反应的影响  25-26
    3.4.3 正交试验方案及结果分析  26-27
  3.5 本章小结  27-28
第四章亲和膜吸附溶菌酶的静态性能的研究  28-35
  4.1 引言  28
  4.2 实验材料与设备  28
    4.2.1 实验材料  28
    4.2.2 实验设备  28
  4.3 实验方法  28-29
    4.3.1 蛋白质含量的测定  28
    4.3.2 亲和膜的制备  28-29
    4.3.3 溶菌酶吸附量与时间的关系  29
    4.3.4 lys 等温吸附曲线  29
    4.3.5 pH 值对溶菌酶吸附性能的影响  29
    4.3.6 温度对溶菌酶吸附性能的影响  29
    4.3.7 离子强度对溶菌酶吸附性能的影响  29
  4.4 结果与讨论  29-34
    4.4.1 吸附动力学曲线  29-30
    4.4.2 温度对溶菌酶吸附量的影响  30
    4.4.3 pH 值对溶菌酶吸附量的影响  30-31
    4.4.4 盐浓度对溶菌酶吸附量的影响  31-32
    4.4.5 35℃下溶菌酶等温吸附曲线  32-34
  4.5 本章小结  34-35
第五章亲和膜在分离纯化蛋白质中的应用  35-44
  5.1 引言  35
  5.2 实验材料与设备  35
    5.2.1 实验材料  35
    5.2.2 实验设备  35
  5.3 实验方法  35-37
    5.3.1 蛋白质含量的测定  35-36
    5.3.2 模柱的制备  36-37
    5.3.3 膜柱吸附溶菌酶动态性能的研究  37
      5.3.3.1 上样速度对溶菌酶吸附量的影响  37
      5.3.3.2 清洗速度对溶菌酶吸附量的影响  37
      5.3.3.3 洗脱速度对溶菌酶吸附量的影响  37
    5.3.4 亲和膜对蛋清中蛋白质分离纯化条件的研究  37
      5.3.4.1 蛋清的预处理  37
      5.3.4.2 蛋清蛋白和乳清蛋白的分离纯化  37
      5.3.4.3 SDS-PAGE 电泳  37
      5.3.4.4 Sephadex G-100 凝胶过滤法  37
  5.4 结果与讨论  37-43
    5.4.1 动态吸附性能的研究  37-39
      5.4.1.1 上样速度对吸附量的影响  37-38
      5.4.1.2 淋洗速度对吸附量的影响  38-39
      5.4.1.3 洗脱速度对吸附量的影响  39
    5.4.2 蛋清蛋白分离纯化的结果鉴定  39-41
    5.4.3 乳清蛋白分离纯化的结果鉴定  41-43
  5.5 本章小结  43-44
主要结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-49
攻读硕士学位期间发表论文情况  49

棉布为载体金属螯合亲和膜的制备及性能研究

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