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短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的抗栓作用研究

作　者: 余瑞铭
导　师: 许云禄
学　校: 福建医科大学
专　业: 药理学
关键词: 短尾蝮蛇蛇毒纤溶酶原激活剂大鼠比格犬抗栓大脑中动脉栓塞数字减影血管造影动脉血栓静脉血栓形成
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

蛇毒是由多种生物活性多肽和蛋白质组成的混合物,由于蛇毒蛋白酶可从凝血、纤溶及血小板聚集等多环节影响血液系统功能[1],因此从蛇毒中研发治疗血栓性疾病的药物,成为国内外研究的热点之一。1993年,张云首次从竹叶青蛇毒中分离纯化出蛇毒纤溶酶原激活剂(TSV-PA),为从蛇毒中开发新型抗栓药物提供新的课题,本课题旨在从江浙产短尾蝮( Gloydius brevicaudus )蛇毒中分离纯化出纤溶酶原激活剂(plasminogen activator from Gloydius brevicaudus venom, GBV-PA),并观察其对动物实验性血栓预防和治疗作用。1.GBV-PA的分离纯化应用苯甲脒琼脂糖凝胶6B (Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析去除短尾蝮蛇毒中大部分的非目的蛋白,目的组分再经Lichrospher C18 4.6/250反相层析柱,在Waters 600E高效液相色谱仪上进行纯化,获得具有间接溶解纤维蛋白作用的第Ⅱ峰,即GBV-PA。GBV-PA经SDS-PAGE鉴定,在β-巯基乙醇还原和非还原条件下,均显示单一条带,提示其为单一肽链的蛋白质,分子量约为34kDa。2.GBV-PA对FeC13诱导的大鼠颈总动脉血栓的溶栓作用以FeC13诱导大鼠颈总动脉血栓形成,以大鼠舌根温度的变化判定血栓的形成和溶解情况。结果大鼠静脉注射GBV-PA150和300μg·kg-1,可以明显提高为FeC13所降低的大鼠舌根温度,该作用持续420min以上;UK2000IU·kg-1静注也能明显提高大鼠舌根温度,但180min后作用开始减弱。比较各组大鼠颈总动脉血栓重量,GBV-PA150和300μg·kg-1组血栓重量分别为25.3±0.06mg和17.6±0.73mg,尿激酶组为22.9±0.73mg,与生理盐水对照组(30.8±2.62mg)相比均有显著性差异(p<0.01),说明GBV-PA对大鼠颈总动脉血栓具有治疗作用,且作用持续时间比尿激酶更长。3.GBV-PA对FeC13诱导的大鼠颈总动脉混合性血栓的抑制作用大鼠颈总动脉血栓模型的制备方法同前,预先静脉注射GBV-PA150和300μg·kg-1,大鼠舌根温度下降值明显小于阴性对照组(p<0.05)。GBV-PA还能明显减轻血栓重量,GBV-PA150和300μg·kg-1组血栓重量分别为21.5±0.13mg和15.2±0.69mg,尿激酶组为20.6±0.33mg,与生理盐水对照组(31.6±0.67mg)比较均有显著差别(p<0.05)。说明GBV-PA可抑制FeC13诱导的大鼠颈总动脉血栓的形成。4.GBV-PA对大鼠颈动静脉(A—V)回路形成的血小板性血栓的抑制作用大鼠颈动静脉(A—V)回路形成后,血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时,发生黏附、聚集,血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓。大鼠静脉注射GBV-PA150和300μg·kg-1能明显减轻血栓重量,GBV-PA150和300μg·kg-1组血栓重量分别为23.3±1.57mg和14.7±0.66mg,阿司匹林组为14.9±0.90mg,与生理盐水对照组(47.1±1.27mg)比较均有显著差别(p<0.01)。说明GBV-PA对血小板性动脉血栓的形成具有明显抑制效应。5.GBV-PA对兔脑粉浸液诱发的大鼠下腔静脉血栓形成的影响兔脑粉悬液富含组织因子,注入下腔静脉后启动外源性凝血途径,诱导血栓形成。大鼠静脉注射GBV-PA150和300μg·kg-1能明显减轻血栓重量,GBV-PA150和300μg·kg-1组血栓重量分别为20.3±2.15mg和12.5±1.44mg,阿司匹林组为16.2±3.15mg,与生理盐水对照组(52.3±12.3mg)比较均有显著差别(p<0.01)。说明GBV-PA可预防大鼠下腔静脉血栓的形成。6.GBV-PA对ADP-Na2诱导的大鼠急性肺栓塞的影响由ADP诱导血小板聚集形成的微小血栓,随同血液流经肺动脉时,造成肺动脉的微栓塞,出现呼吸窘迫征,大鼠出现呼吸喘促等症状。记录大鼠呼吸喘促的持续时间,GBV-PA150和300μg·kg-1组分别为189.3±12.4s和131.2±12.0s,阿司匹林组为159.9±14.2s,与生理盐水对照组(918.2±82.4s)比较均有显著差别(p<0.01)。说明GBV-PA可明显缩短ADP诱导的血小板聚集性肺栓塞引起呼吸喘促的时间。7.GBV-PA对实验性犬急性脑梗塞的治疗作用采用介入技术建立比格犬急性大脑中动脉栓塞模型,栓塞后行数字减影脑血管造影观察所栓塞血管的再通情况。19只比格犬随机分为GBV-PA 18.75、37.5和75μg·kg-1低、中和高剂量组,阳性对照组为104IU·kg-1剂量的rt-PA,阴性对照组为生理盐水。1小时rt-PA组、GBV-PA低剂量、中剂量和高剂量组的血管再通率分别为100%(2/2)、0%(0/4)、25%(1/4)和50%(2/4), 2小时各组的再通率分别为100%、0%、50%和75%,3小时各组的再通率分别为100%、50%、75%和100%,生理盐水组3h内均未发现血管再通。说明GBV-PA各剂量组的血管再通率存在明显的量效和时效关系,随着用药剂量的增大和药物作用时间的延长,血管再通率上升。结论:大鼠iv GBV-PA150和300μg·kg-1均可显著促进为FeC13诱导的颈总动脉血栓的消退,且作用持续时间比尿激酶更长;大鼠iv GBV-PA150和300μg·kg-1均可抑制FeC13诱导的大鼠颈总动脉血栓的形成;大鼠iv GBV-PA150、300μg·kg-1均可显著抑制大鼠颈动静脉回路产生的血小板性血栓的形成;大鼠iv GBV-PA150、300μg·kg-1均可显著抑制兔脑粉诱发的大鼠下腔静脉血栓的形成;GBV-PA在体内能明显对抗ADP诱导的大鼠体内血小板聚集;犬动脉内输注GBV-PA18.75、37.5和75μg·kg-1对实验性犬急性脑梗塞具有治疗作用,血管再通率存在明显的量效和时效关系。

全文目录

英文缩写索引  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-13
Ⅰ. 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化  13-19
  1. 材料  13-14
  2. 方法  14-16
    2.1 短尾蝮蛇蛇毒纤溶酶原激活剂（GBV-PA）的分离纯化  14-16
      2.1.1 亲和层析  14
      2.1.2 分离组分的活性鉴定  14-15
      2.1.3 C18反相层析  15
      2.1.4 GBV-PA纯度鉴定  15-16
  3. 结果  16-19
Ⅱ. 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的抗栓作用研究  19-34
  1. 材料  19-20
  2. 方法  20-23
    2.1 GBV-PA对FeC1_5诱导的大鼠颈总动脉血栓的溶栓作用  20
    2.2 GBV-PA对FeC1_5 诱导的大鼠颈总动脉混合性血栓的抑制作用  20
    2.3 GBV-PA对大鼠颈动静脉(A—V)回路形成的血小板性血栓的抑制作用  20-21
    2.4 GBV-PA对兔脑粉浸液诱发的大鼠下腔静脉血栓形成的影响  21
    2.5 GBV-PA对ADP-Na_2诱导的大鼠急性肺栓塞的影响  21
    2.6 GBV-PA对实验性犬急性脑梗塞的治疗作用  21-23
      2.6.1 动物分组及给药方案  21
      2.6.2 血栓制备  21-22
      2.6.3 模型制备  22
      2.6.4 给药时间  22
      2.6.5 闭塞血管再通判断  22
      2.6.6 统计学处理  22-23
  3 结果  23-34
讨论  34-37
  1.GBV-PA的分离纯化  34
  2.血栓模型的研究  34-35
  3.GBV-PA抗栓作用研究  35-37
结论  37-38
参考文献  38-40
致谢  40-41
综述  41-47

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的抗栓作用研究

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