学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

山羊弓形虫病免疫胶体金快速检测试纸条的研制

作　者: 李聪颖
导　师: 许应天
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 山羊弓形虫病表面抗原基因免疫胶体金诊断
分类号: S858.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 134次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种重要人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布,感染范围广,对人畜安全构成极大威胁。目前弓形虫疫苗的研究尚处于动物试验阶段,其安全性和有效性有待验证,所以推进弓形虫诊断技术的研究显得尤为重要。目前弓形虫病的诊断方法主要分为病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断,免疫胶体金检测技术作为免疫学诊断方法,以其操作简单、敏感特异、稳定性强、不需要特殊设备和结果判断直观等优点,被广泛应用于病原微生物、毒素、药物残留等方面的检测。本试验采用重组弓形虫速殖子膜表面蛋白SAG2(P22)作为诊断抗原,利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,与葡萄球菌A蛋白(SPA)结合形成探针,采用超速离心法纯化探针,对试纸条制备条件进行筛选,组装山羊免疫胶体金快速检测试纸条,并对试纸条的灵敏性、特异性和可靠性进行分析。本试验扩增了弓形虫SAG2基因,构建pGEX-4T-1-SAG2重组质粒,通过大肠杆菌表达和切胶纯化,得到高纯度的重组SAG2蛋白。筛选得出试纸条制备的最佳条件：20nm粒径的胶体金在pH6.4的条件下标记25ug·L-1SPA形成的探针结合最牢固,以四硼酸钠稀释探针,以BSA+NaN3+聚乙二醇10000混合液作为探针稳定剂,以Sartorius CN140型硝酸纤维膜作为载体,以1.0mg mg·L-1的重组SAG2蛋白包被检测线,以0.9mg mg·L-1马抗山羊IgG包被质控线,组装的免疫胶体金检测试纸条检测效果最好。试纸条检测弓形虫阳性血清的稀释倍数可达到1：5120,与山羊球虫阳性血清、山羊布氏杆菌、日本血吸虫阳性血清均无交叉反应。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-18
  1 弓形虫病诊断的研究进展  10-14
    1.1 临床诊断  10
    1.2 实验室诊断  10-12
    1.3 分子生物学诊断方法  12-14
  2 弓形虫SAG2基因的研究进展  14-15
    2.1 SAG2蛋白的免疫原性  14-15
    2.2 SAG2蛋白的临床应用潜在价值  15
  3 胶体金检测技术的研究进展  15-17
    3.1 胶体金检测技术的原理  15
    3.2 免疫胶体金的制备  15-16
    3.3 胶体金探针的制备  16
    3.4 免疫胶体金检测技术的分类及其应用  16-17
    3.5 免疫胶体金检测技术的优缺点  17
  4 本研究的目的及意义  17-18
材料与方法  18-26
  1 材料  18-20
    1.1 细菌菌株、虫种和质粒载体  18
    1.2 实验动物  18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 主要仪器  18
    1.5 主要试剂的配制  18-20
  2 方法  20-26
    2.1 弓形虫SAG2基因的克隆与原核表达  20-21
    2.2 胶体金免疫层析鉴别诊断试纸的研制  21-26
结果  26-36
  1 弓形虫SAG2基因的PCR扩增产物鉴定  26
  2 重组质粒PMD18-T-SAG2的PCR及酶切鉴定  26-27
  3 原核表达载体的构建  27
  4 SAG2基因的原核表达及鉴定  27-29
  5 胶体金质量的鉴定  29-30
    5.1 目测鉴定结果  29
    5.2 电镜鉴定结果  29-30
    5.3 胶体金烧制方法的筛选结果  30
  6 胶体金的标记  30-33
    6.1 SPA与胶体金结合的最佳pH确定  30-32
    6.2 SPA与胶体金结合的最佳浓度的确定  32
    6.3 胶体金探针的鉴定  32-33
    6.4 胶体金探针稳定性试验  33
  7 试纸的制备  33-34
    7.1 金标垫的制备  33
    7.2 不同NC膜的优化结果  33
    7.3 T线及C线包被液的优化结果  33-34
    7.4 试纸的组装及检测结果的判定  34
  8 敏感性试验  34
  9 特异性试验  34-35
  10 可靠性试验  35
  11 样本检测  35-36
讨论  36-40
结论  40-41
参考文献  41-47
致谢  47-48
作者简介  48

山羊弓形虫病免疫胶体金快速检测试纸条的研制

内容摘要

全文目录

相似论文