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肠道病毒71型病毒样颗粒的制备、纯化与鉴定

作　者: 蒋维
导　师: 盛望
学　校: 北京工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肠道病毒71型 病毒样颗粒 疫苗 酿酒酵母
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


手足口病是婴幼儿的一种常见传染病。EV71是引起患者手足口病的主要病原体之一,同时还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病,严重威胁了儿童的生命健康,预防EV71的流行十分重要。据统计,2009年我国共报告手足口病病例约115.5万例(不含港、澳、台),死亡病例353例,占我国丙类传染病发病数第一位。至今尚无有效的针对性的疫苗预防EV71的感染,只能提高监测的强度和灵敏度,早发现,早治疗。因此研制针对EV71的预防性疫苗对控制婴幼儿手足口病的流行具有十分重要的意义。本课题选择利用酿酒酵母表达系统发酵表达EV71 VLP。首先参照酿酒酵母基因中的优势密码子,运用分子生物学技术对EV71 P1和3CD基因进行设计和全基因合成。将合成的基因序列克隆到酿酒酵母表达载体上,转化酿酒酵母进行诱导表达。同时扩增EV71 VP1、VP2、VP3和VP4四个基因,克隆到酿酒酵母表达载体上,转化酿酒酵母进行诱导表达。其次,对诱导后的酵母细胞进行破碎,利用蛋白沉淀、氯化铯密度梯度离心等纯化方法初步纯化分离VLP。对纯化后样品进行Western Blot检测鉴定;并通过负染电镜观察VLP。本课题利用两种方法在酿酒酵母中表达EV71 VLP:1.将VP1、VP2、VP3和VP4四个基因共同转化酵母细胞,可以在酿酒酵母细胞中表达,并自行组装成VLP。2. P1和3CD蛋白可以在酿酒酵母中成功表达,蛋白酶3CD将P1蛋白切割成VP1、VP2、VP3和VP4,后者在酿酒酵母中自行组装成VLP。实验中初步纯化的VLP可作为EV71预防性疫苗进行下一步研究。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
英文缩写词  6-9
第1章 绪论  9-17
  1.1 研究背景  9
  1.2 EV71 的病毒学研究  9-10
  1.3 EV71 的疫苗研究现状  10-14
    1.3.1 灭活疫苗  11-12
    1.3.2 减毒活疫苗  12
    1.3.3 载体疫苗  12-13
    1.3.4 多肽疫苗  13
    1.3.5 蛋白疫苗  13
    1.3.6 DNA 疫苗  13
    1.3.7 病毒样颗粒疫苗  13-14
    1.3.8 展望  14
  1.4 本课题研究目的和内容  14-15
  1.5 本课题研究技术路线  15-17
第2章 EV71 酵母表达载体的构建  17-37
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 菌株与质粒  17
    2.1.2 工具酶与试剂  17
    2.1.3 序列合成与测序  17
    2.1.4 主要仪器  17-18
    2.1.5 其它需配制的溶液  18
  2.2 实验方法  18-26
    2.2.1 优化EV71 P1 和3CD 基因的设计和全基因合成  18-20
    2.2.2 EV71 P1 基因酵母表达载体pESCU- P1/3CD 的构建  20-25
    2.2.3 EV71 酵母表达质粒pESCU-VP1/VP4 和pESCH-VP3/VP2 的构建  25-26
  2.3 实验结果  26-34
    2.3.1 优化EV71 P1 和3CD 基因的设计  26-28
    2.3.2 EV71 P1 基因酵母表达载体pESCU-P1/3CD 的构建  28-31
    2.3.3 EV71 酵母表达载体pESCU-VP1/VP4 和pESCH-VP3/VP2 的构建  31-34
  2.4 讨论  34-35
  2.5 本章小结  35-37
第3章 EV71 病毒样颗粒的表达与鉴定  37-49
  3.1 实验材料  37-39
    3.1.1 菌株  37
    3.1.2 工具酶与主要试剂  37
    3.1.3 主要仪器  37-38
    3.1.4 主要溶液配置  38-39
  3.2 实验方法  39-43
    3.2.1 病毒样颗粒的表达  39-41
    3.2.2 VLP 的初步纯化  41-42
    3.2.3 VLP 的鉴定  42-43
  3.3 实验结果  43-46
    3.3.1 对EV71 VLP 的初步纯化  43-44
    3.3.2 透射电镜观察EV71 病毒样颗粒  44-45
    3.3.3 Western Blot 检测P1 蛋白的表达  45-46
  3.4 讨论  46-47
  3.5 本章小结  47-49
结论  49-51
参考文献  51-55
附录  55-61
攻读硕士学位期间发表的学术论文  61-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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