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宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经元重建的研究

作　者: 马丽丽
导　师: 袁正伟
学　校: 中国医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 骨髓间充质干细胞宫内移植先天性脊椎裂分化神经元重建
分类号: R748
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的神经管缺陷(Neural tube defects, NTDs)是常见的先天性畸形之一,世界范围内发病率占总出生儿数的1／1000～9／1000,是世界卫生组织常规监测的疾病之一,目前认为神经管缺陷是遗传因素和环境因素共同作用的结果,有家族遗传倾向。胚胎发育过程中神经管发育缺陷可出现脑和脊髓畸形,其中脑裂和脊柱裂占所有类型的95%,脊柱裂根据椎管内容物是否突出脊柱皮肤分为显性脊柱裂和隐性脊柱裂。随着产前诊断技术的不断提高,越来越多的神经管畸形在孕中期或孕早期被发现,但是产前治疗方面的研究却进展缓慢,许多母亲被迫选择终止妊娠,出生后的神经畸形患儿的致残率和死亡率也较高。目前国内外应用胎儿外科技术进行产前修补可以减少脑积水和脑疝的发生率,但对神经功能的恢复仍不理想,下肢感觉运动功能障碍和尿便障碍仍然是常见的术后并发症。干细胞移植治疗出生缺陷是目前较先进的治疗方法,宫内移植的优点包括：1.由于胎儿在宫内生长发育快,因此为植入的干细胞生长繁殖提供了有利时机；2.MSCs经诱导分化后进行自体移植,不存在免疫反应,而且避免了社会伦理问题；3.能够在疾病的早期得以及时治疗。目前利用干细胞移植技术治疗白血病及先天性免疫缺陷性疾病以有报道,但关于宫内干细胞移植治疗神经管畸形的报道却很少。先天性神经管发育畸形的治疗一直是困扰国内外学者的难题。我们前期研究发现,先天性脊椎裂鼠支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动神经元数量明显减少,说明脊柱裂的脊髓神经元在胚胎期已经存在明显发育异常。因此我们认为在显性脊椎裂患儿术后神经功能恢复的治疗中,神经元的再生或修复才是最重要的治疗原则。移植的骨髓间充质干细胞(MSCs)可以转化为神经细胞,这为先天性神经系统发育异常和神经系统退行性疾病的细胞替代治疗提供了可能。因此本研究尝试利用MSCs进行宫内移植治疗先天性脊椎裂,并对移植后干细胞的迁移和分化情况进行评价,探索先天性脊椎裂的治疗新方法。材料和方法一、实验动物1、原代培养4周龄Wistar鼠40只,体重90-100g。由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。2、动物模型10-12周龄Wistar孕鼠100只,体重250-300g。二、方法1、原代培养及腺病毒-EGFP转染：无菌条件下取大鼠骨髓用全骨髓贴壁培养法进行原代培养,腺病毒-EGFP(MOI值300-500)转染PO-P15代骨髓MSCs。2、胎鼠先天性脊椎裂动物模型的建立：孕10进行4%维甲酸(140mg/kg)胃管给药,利用药物致畸方法制作先天性脊椎裂动物模型。3、干细胞移植：利用胎仔外科方法将转染EGFP的MSCs经纤细玻璃针注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中,并存活至20天,剖宫取胎。4、冰冻连续切片计数移植细胞的存活数量：取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冰冻切片,计数脊髓中绿色荧光细胞数量及分布情况。5、免疫荧光方法检测移植细胞的分化情况：免疫荧光方法检测脊髓冰冻切片中EGFP阳性MSCs中Nestin、NF、GFAP、Myod的表达。结果一、细胞浓度流式细胞仪鉴定全骨髓细胞悬液贴壁法得到MSCs纯度,发现细胞培养时间越长,干细胞的纯度越高。二、孕鼠及胎鼠存活率被移植孕鼠共86只,术后存活并得到脊柱裂标本的孕鼠共81只,孕鼠存活率94%。每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠,最后存活的胎鼠比例为78%。三、细胞存活情况通过对实验结果计数分析,移植MSCs的总存活率为24%。并且发现不同浓度MSCs、不同代数的MSCs和不同移植时间对MSCs存活率都有不同的影响：在孕16天、17天和18天时移植相同代数的MSCs,结果发现孕16天存活率明显低于孕17和18天, (P<0.05)；在相同移植时间(16天移植MSCs), PO代MSCs存活率最低, P3-6和P10-14代无明显差别(P>0.05)；移植MSCs细胞数量不同对存活率影响不大(P>0.05)四、细胞分化情况免疫荧光法检测MSCs移植到脊髓中分化情况,发现移植MSCs不仅分化为不同神经细胞,包括神经干细胞(Nestin)、神经元(Neurofilament)和神经胶质细胞(GFAP)。而且可分化为肌原细胞(MyoD)。分化率在P10-14代MSCs明显高于P3-6代MSCs,在16天移植明显高于孕17天和18天(P<0.01)。结论1、提示利用胎仔外科进行宫内干细胞移植治疗先天性脊椎裂可能是可行的办法。2、移植MSCs可在胎鼠脊髓组织中分化为神经干细胞、神经元、神经胶质细胞和肌原细胞。3、P10-14代MSCs在孕16天移植可获得较高的分化率,在本实验中是胚胎期移植的最佳条件。

全文目录

一、摘要  4-11
  中文论著摘要  4-7
  英文论著摘要  7-11
二、英文缩略语  11-12
三、论文  12-28
  前言  12
  材料与方法  12-15
  结果  15-24
  讨论  24-27
  结论  27-28
四、本研究创新性的自我评价  28-29
五、参考文献  29-32
六、附录  32-43
  综述  32-41
  在学期间科研成绩  41-42
  致谢  42-43
  个人简历  43

宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经元重建的研究

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