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金龟子绿僵菌种衣剂的研制

作　者: 杨震元
导　师: 李增智；黄勃
学　校: 安徽农业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 剂型生物型种衣剂生物测定成膜剂抗氧化剂生长调节剂
分类号: S476.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 151次
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内容摘要

本研究以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)为活性成分,以玉米蛴螬为目标害虫,通过各种助剂的优化配伍,研制出金龟子绿僵菌的生物型种衣剂。用绿色荧光蛋白给金龟子绿僵菌标记,采用已研制的配方给玉米种子包衣,定期测定金龟子绿僵菌在玉米根际的定殖情况,评价了该种衣剂防治地下害虫的潜力。并通过玉米田间试验,证明了该剂型的实际应用效果。通过生物测定,比较了布氏白僵菌和金龟子绿僵菌的五个菌株对暗黑鳃金龟的毒力。在浓度为1×107孢子/ml时,Bbr06、Bbr17、Ma09、Ma20、Ma55的侵染率分别为13.33%、22.22%、42.22%、68.89%、95.56%,其中以Ma55最高。当浓度为1×107、1×108、1×109孢子/ml时,其LT50分别为10.93、9.12、7.65d。在种衣剂剂型研究中,以Ma55为试验菌株,通过溶剂油、成膜剂、抗氧化剂、植物生长调节剂与其分生孢子的长期相容性试验,得出最佳助剂。孢油比为0.2g /ml、0.1g /ml、0.05g /ml时,B油第90d的萌发率均显著高于其他溶剂油(P<0.05);且都显著高于对照组室温和25℃时的萌发率(P<0.05);同时,与4℃对照组萌发率差异不显著(P>0.05)。由此可以得出B油为最佳油剂油。成膜剂JX各项物理指标都是最优的,种子出苗率与对照组差异不显著(P>0.05),且成膜剂JX在三种浓度下(0.1%、0.5%、1%)萌发率均显著高于其他两种(P<0.05)。在三种不同的浓度下(0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml),TBHQ都表现出更为优异的清除自由基活性;在相容性试验中,当浓度为0.1mg/ml时,孢子萌发率显著高于其他两种(P<0.05)。在植物生长调节剂的试验中,在NAA的三种浓度下(1ppm、2ppm、3ppm),孢子萌发率显著高于6-BA(P<0.05)。从而得出最佳助剂为B溶剂油、JX、TBHQ、NAA。采用二次通用回归旋转设计的方法研究了成膜剂、抗氧化剂、植物生长调节剂的最佳配比。通过对比实验,结合各助剂的特性得出金龟子绿僵菌种衣剂的配方为:B油剂油,孢油比为0.1g/ml,成膜剂为0.05%的JX,抗氧化剂为0.1mg/ml的TBHQ,植物生长调节剂为2ppm的NAA。在研究金龟子绿僵菌在玉米根际的定殖试验中,利用草胺磷抗性基因bar为筛选标记,将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入载体pbarGPE1,得到了组成性表达载体pGPE-GFP,并转入金龟子绿僵菌Ma55,获成功表达。用含有gfp基因的金龟子绿僵菌孢子粉配制种衣剂,并给玉米种子包衣。对玉米苗期根际定殖情况进行定期取样观测。结果表明,与非根际土壤相比,在根际土壤中被标记的绿僵菌的带菌量不仅最大,而且在播种后第10天数量达到最大,然后在第20～30d内数量即不再显著变动。相比之下,非根际土壤中的带菌量不仅极显著少于根际土壤,且随时间的延长明显降低;在表层土中的带菌量很低,而且也随时间的延长显著降低。这些证据表明,应用该种衣剂剂型,金龟子绿僵菌孢子在玉米根际有较高活力和定殖效果,从而为该生物型种衣剂防治地下害虫的利用潜力提供了依据。分别以三种包衣浓度(1:10、1:25、1:50)对玉米做了田间试验,在播种后第10天统计其出苗率。出当包衣比例为1:25、1:50时,出苗率与对照组差异不显著(P>0.05);在第30天时,统计防虫效果。当包衣比例为1:10、1:25时,虫害苗率均与对照组差异显著(P<0.05),而以1:25效果较好。这表明金龟子绿僵菌种衣剂对防治玉米地下害虫具有良好前景。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 文献综述  10-20
  1.1 利用虫生真菌进行生物防治的研究  10-12
  1.2 真菌杀虫剂剂型的重要性及其研究现状  12-14
  1.3 种衣剂的研究现状  14-16
  1.4 生物型种衣剂的研究  16-17
  1.5 金龟子绿僵菌的大量生产  17-18
  1.6 真菌制剂在环境中的监测  18-20
2 引言  20-22
3 材料与方法  22-37
  3.1 试验流程图  22
  3.2 生物测定  22-23
    3.2.1 供试昆虫  22
    3.2.2 供试菌株  22-23
    3.2.3 生物测定  23
    3.2.4 数据处理与分析  23
  3.3 金龟子绿僵菌孢子粉的制备  23-25
    3.3.1 菌株及培养基  23-24
    3.3.2 孢子粉制备  24
    3.3.3 初生产孢子粉质量指标测定  24-25
    3.3.4 孢子粉的干燥处理  25
  3.4 绿僵菌种衣剂助剂的筛选  25-27
    3.4.1 溶剂油的筛选及最佳孢油比  25
    3.4.2 成膜剂筛选及对出苗率的影响  25-26
    3.4.3 抗氧化剂的筛选  26-27
    3.4.4 植物生长调节剂筛选  27
  3.5 各种助剂优化配伍试验  27-31
    3.5.1 二次通用回归旋转设计  27-30
    3.5.2 数据处理  30-31
  3.6 GFP 基因标记法研究金龟子绿僵菌在根际的定殖情况  31-36
    3.6.1 材料  31
    3.6.2 主要的培养基  31-32
    3.6.3 主要的试剂  32
    3.6.4 pGPE-GFP 载体的构建  32-34
    3.6.5 原生质体转化Ma55  34
    3.6.6 金龟子绿僵菌基因组的提取  34-35
    3.6.7 真菌转化子的PCR 初步筛选与验证  35-36
    3.6.8 真菌转化子的继代培养  36
    3.6.9 包衣玉米播种后不同部位土壤中金龟子绿僵菌数量的检测  36
    3.6.10 荧光检测  36
  3.7 金龟子绿僵菌种衣剂的田间试验  36-37
    3.7.1 供试材料  36
    3.7.2 试验设计  36-37
4 结果与分析  37-56
  4.1 生物测定分析  37-40
    4.1.1 不同菌株对蛴螬的致病力  37-38
    4.1.2 菌株Ma55 时间-剂量-死亡率模型模拟  38
    4.1.3 时间-剂量-死亡率模型模拟  38-40
  4.2 金龟子绿僵菌孢子粉的生产  40-41
  4.3 溶剂油相容性试验及其筛选  41-43
  4.4 成膜剂筛选试验  43-44
    4.4.1 成膜剂相容性筛选  43-44
    4.4.2 成膜剂物理性筛选  44
  4.5 抗氧化剂筛选试验  44-46
    4.5.1 抗氧化性筛选  44-45
    4.5.2 抗氧化剂相容性筛选  45-46
  4.6 植物生长调节剂筛选试验  46
  4.7 二次通用回归旋转设计数据处理  46-47
  4.8 最佳配比的相容性储存实验  47-48
  4.9 工艺流程  48-49
  4.10 产品规格和质量检验方法  49-51
    4.10.1 种衣剂的产品规格  49
    4.10.2 产品检测方法  49-51
  4.11 金龟子绿僵菌在玉米根际的定殖情况  51-54
    4.11.1 GFP 组成性表达载体的构建及酶切验证  51-52
    4.11.2 转化子继代培养的PCR 验证  52-53
    4.11.3 金龟子绿僵菌Ma55 在玉米根际的定殖情况  53-54
  4.12 玉米的田间试验  54-56
    4.12.1 种衣剂对玉米出苗率的影响  54
    4.12.2 种衣剂的防虫效果  54-56
5 讨论  56-58
  5.1 优良菌株的筛选及剂型优化配伍  56
  5.2 金龟子绿僵菌在植物根际的定殖情况  56
  5.3 金龟子绿僵菌种衣剂的田间试验  56-58
6 结论  58-59
  6.1 金龟子绿僵菌种衣剂研制  58
  6.2 MA55 在玉米根际的定殖  58
  6.3 种衣剂应用玉米的田间试验  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
作者简介  67
在读期间发表的学术论文  67

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