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高产2，5-二甲基-4-羟基-3（2H）-呋喃酮酵母菌株的选育及培养环境的研究

作　者: 张海林
导　师: 范文来
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: Furaneol 高产DMHF菌筛选 季也蒙毕赤氏酵母 高渗透压 细胞膜通透性
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone,DMHF)是一种高档羟基呋喃酮类香料。DMHF在稀溶液中呈现草莓香,在浓溶液中呈现焦糖香。DMHF香气阈值较低,增香作用强,广泛用于食品领域。天然DMHF价格昂贵,利用微生物发酵法生产天然DMHF前景广阔。本文选育了一株高产DMHF酵母菌株,并对影响DMHF生成的相关因素进行了研究。主要结论如下:(1)从酒曲中筛选到一株DMHF产量为36.2mg/L的优良酵母菌株SX-21。经18S rDNA和形态特征鉴定,SX-21为Pichia guilliermondii(季也蒙毕赤氏酵母)。(2) SX-21菌株经紫外诱变、亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到一株高产DMHF的突变菌株NTG-SX-103。在100 g/L 1,6-二磷酸果糖(FDP)培养基中,NTG-SX-103菌株DMHF产量可达92.5mg/L,比出发菌株提高了1.5倍。(3)对影响NTG-SX-103菌株生产DMHF的因素进行单因素实验考察,发现前驱物质FDP、NaCl、起始pH、摇床转速是影响DMHF生成的关键因素。在含有100g/L FDP、120g/L NaCl的麦汁培养基中,起始pH5.8,250r/min条件下, DMHF产量为205.2mg/L,是初始条件下DMHF产量(45.6 mg/L)的4.5倍。在400g/L FDP培养基中,DMHF产量达到704.7mg/L,高于文献报道的最高产量100 mg/L。(4)高浓度NaCl能极大地促进DMHF的生成。在添加120g/L NaCl的培养基中DMHF产量是不添加NaCl的3.8倍。添加高浓度不可利用的山梨醇代替NaCl,亦能极大促进DMHF生成。高浓度NaCl造成的高渗透压环境促进了DMHF的生成。添加渗透压的传递信使Ca2+,DMHF产量提高了50%。(5)通过在260nm处检测细胞泄露的核酸、420nm处检测细胞外的邻硝基酚,发现高渗透压的环境下细胞膜的通透性有着较大的增加。FDP在发酵过程中基本没有被利用,大量存在于细胞外。高浓度NaCl促使细胞膜的通透性增大,有利于FDP以及FDP代谢物质与生成DMHF的相关酶结合,促进DMHF生成。添加表面活性剂、化学试剂,增加细胞膜的通透性,亦能促进DMHF生成。细胞膜通透性是影响DMHF生成的重要因素。(6)提取细胞外酶液、细胞内酶液、细胞膜酶液,分别添加NADPH、FDP,发现只有细胞膜酶液能转化FDP生成DMHF,而其它酶液则不能。生成DMHF的相关酶位于细胞膜上。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 绪论  8-13
  1.1 立题的背景和意义  8
  1.2 国内外研究进展  8-12
    1.2.1 微生物生产DMHF 的研究进展  9-10
    1.2.2 草莓植物体中合成DMHF 的研究进展  10-11
    1.2.3 化学合成DMHF 的研究进展  11-12
  1.3 课题研究的主要目标及内容  12-13
    1.3.1 课题研究的主要目标  12
    1.3.2 课题研究的思路与内容  12-13
第二章 实验材料与方法  13-20
  2.1 试验材料  13-14
    2.1.1 筛选对象  13
    2.1.2 培养基  13
    2.1.3 主要试剂  13-14
    2.1.4 主要试剂配制  14
    2.1.5 主要仪器  14
  2.2 实验方法  14-20
    2.2.1 DMHF 气相检测方法  14-15
    2.2.2 产DMHF 酵母菌株的筛选方法  15-16
    2.2.3 分子鉴定方法  16
    2.2.4 常规形态观察  16
    2.2.5 诱变育种筛选方法  16-17
    2.2.6 紫外诱变方法  17
    2.2.7 亚硝基胍（NTG）诱变方法  17
    2.2.8 细胞计数方法  17
    2.2.9 发酵液中FDP 测定方法  17-18
    2.2.10 酵母细胞破碎方法  18
    2.2.11 酵母中各种酶液抽提方法  18-19
    2.2.12 3,4-二羟基-2,5-己二酮化学合成方法  19-20
第三章 实验结果与讨论  20-42
  3.1 产DMHF 酵母菌种的筛选与鉴定结果  20-21
    3.1.1 产DMH F 菌株筛选结果  20
    3.1.2 SX-21 菌株鉴定结果  20-21
  3.2 SX-21 生成的DMHF 初始培养基的初步选择  21-22
  3.3 发酵液中 DMHF 的定性检测  22
  3.4 诱变育种  22-24
    3.4.1 紫外诱变育种  22-23
    3.4.2 NTG 诱变育种  23
    3.4.3 突变菌株NTG-SX-103 遗传稳定性  23-24
  3.5 影响DMHF 生成的关键因素  24-31
    3.5.1 不同的糖对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  24-25
    3.5.2 不同浓度FDP 对NTG-SX-103 生产DMHF 的影响  25-26
    3.5.3 氮源对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  26
    3.5.4 发酵温度对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  26-27
    3.5.5 不同接种量对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  27-28
    3.5.6 起始pH 对NTG-SX-103 生产 DMHF 的影响  28
    3.5.7 摇床转速对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  28-29
    3.5.8 不同浓度NaCl 对NTG-SX-103 生产DMHF 的影响  29-30
    3.5.9 发酵过程中各参数变化曲线  30
    3.5.10 FDP 做唯一碳源  30
    3.5.11 影响NTG-SX-103 生成DMHF 的关键因素  30-31
  3.6 高盐环境对NTG-SX-103 生产DMHF 的影响  31-37
    3.6.1 高渗透压的培养环境能促进DMHF 的生成  31
    3.6.2 Ca~(2+) 对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  31-32
    3.6.3 高渗透压环境中细胞内外DMHF 含量  32-33
    3.6.4 细胞膜的通透性对NTG-SX-103 生成DMHF 的影响  33-34
    3.6.5 细胞膜通透性检测  34-35
    3.6.6 生成DMHF 的相关酶位于细胞膜上  35-36
    3.6.7 添加高浓度FDP 来代替高浓度NaCl 增加DMHF 产量  36-37
  3.7 主要结论  37
  3.8 讨论  37-42
致谢  42-43
参考文献  43-46
附录  46

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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