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产PHB的隐藏嗜酸菌DX1-1的诱变改良和不同营养条件下胞内蛋白表达差异

作　者: 张帅
导　师: 杨宇；夏金兰
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: Acidiphilium cryptum DX1-1 聚-β-羟基丁酸酯 紫外诱变 钴60诱变 双向电泳 胞内蛋白 质谱分析
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


聚β-羟基丁酸（poly-β-hydroxybutyric butyric acid PHB）是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下,作为碳源和能源贮存在生物体内的一类热塑性聚酯。它作为微生物合成的可降解材料,除了具有与化学合成高分子相似的性质外,还具有一般化学合成高分子没有的性质,如光学活性好、透氧性低、抗紫外线辐射、生物可降解性、生物组织相容性、压电性和抗凝血性等,具有广阔的应用前景,越来越受到人们的关注。国内外的许多公司和科研机构纷纷开展可降解塑料的研发工作。本文综述着重介绍PHB的理化性质、检测方法、生物合成、降解以及基因改良菌种方面的研究进展,同时对其应用、目前存在的问题以及可能的解决方案进行讨论。从取自江西德兴铜矿的酸性矿坑废水中分离出一株菌株（DX1-1）,经16s鉴定为Acidiphilium cryptum菌,透射电镜显示该菌胞内可积累大量颗粒状聚合物。提取该聚合物并进行红外、紫外吸收光谱检测,结果显示该聚合物具有聚-β-羟基丁酸酯（PHB）的典型特征。研究表明DX1-1菌株具有生产生物可降解材料（PHB）的潜力。采用紫外线照射和放射性元素钴60辐射诱变方法,对分离纯化的一株可积累聚β-羟基丁酸酯（PHB）的Acidiphilium cryptum DX1-1进行了诱变改良,以获得PHB高产菌。结果显示钴60诱变最佳诱变剂量为200Gy,紫外诱变的最佳剂量为15W、30cm、60s,紫外诱变的效果比钴60诱变的效果好。诱变后筛选得到的一株菌UV60-3,PHB含量达到28.56 g/L,是原出发菌株的1.45倍,并且可稳定遗传。对菌株UV60-3积累PHB的碳氮比进行了探索,结果显示在碳源（葡萄糖）浓度15g/L,氮源（硫酸铵）浓度30g/L,C/N为0.94时PHB含量最高,PHB含量达30.57 g/L。对诱变前后和不同碳氮比条件下的Acidiphilium cryptum DX1-1进行蛋白表达差异分析,提取不同氮源浓度培养条件下的胞内蛋白,摸索试验条件,获得清晰可重复性强的双向电泳结果。经过软件分析选择在3%（NH4）2SO4浓度下差异表达点9个,送样暨南大学水生生物学院做质谱鉴定。通过MALDI-TOF/MS质谱分析得到匹配结果的有8个样品,经过分析鉴定出与PHB合成代谢直接相关的蛋白点4个。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩写词简表  8-12
第一章 文献综述  12-28
  1.1 PHB的性质和应用  13-15
    1.1.1 PHB的性质  13-14
    1.1.2 PHB的应用  14-15
  1.2 PHB的生物合成  15-18
  1.3 PHB在细胞中积聚的状态  18-19
  1.4 PHB的降解  19-21
  1.5 PHB提取方法  21-22
    1.5.1 有机溶剂提取  22
    1.5.2 次氯酸钠提取  22
    1.5.3 氯仿-次氯酸钠提取  22
  1.6 PHB的检测方法  22-23
  1.7 基因工程技术在PHB合成中的应用  23-25
    1.7.1 基因工程技术在PHB提取上的应用  23-24
    1.7.2 基因工程技术在构建基因重组菌方面的应用  24
    1.7.3 基因工程技术在构建基因重组植物方面的应用  24
    1.7.4 基因工程技术在PHB改性方面的应用  24-25
  1.8 课题的研究目的与研究内容  25-28
    1.8.1 研究依据  25-27
    1.8.2 研究目的  27
    1.8.3 论文课题受资助情况  27
    1.8.4 论文的主要研究内容  27-28
第二章 积累PHB菌株Acidiphilium cryptum DX1-1的诱变改良  28-38
  2.1 材料和方法  28-30
    2.1.1 菌种  28
    2.1.2 仪器  28
    2.1.3 培养基  28
    2.1.4 试验方法  28-30
  2.2 结果与分析  30-35
    2.2.1 出发菌DX1-1生长和PHB积累  30-32
    2.2.2 紫外线诱变  32-34
    2.2.3 Co~(60)诱变作用  34-35
    2.2.4 诱变菌积累PHB的碳氮比  35
  2.3 讨论  35-37
  2.4 本章小结  37-38
第三章 Acidiphilium cryptum DX1-1胞内蛋白双向电泳条件的建立  38-51
  3.1 材料和仪器  38-40
    3.1.1 主要试剂  38
    3.1.2 主要仪器设备和软件  38-39
    3.1.3 主要溶液成及配制  39-40
  3.2 主要方法  40-45
    3.2.1 PHB积累和生长条件测定  40
    3.2.2 细胞收集  40-41
    3.2.3 胞内蛋白提取  41
    3.2.4 考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度  41-42
    3.2.5 SDS-PAGE分析  42-43
    3.2.6 固相pH梯度—SDS双向凝胶电泳  43-45
  3.3 结果与分析  45-49
    3.3.1 PHB产量和菌体生长条件  45
    3.3.2 SDS-PAGE结果  45-46
    3.3.3 Acidiphilium cryptum双向电泳条件的建立  46-48
    3.3.4 可重复性鉴定  48-49
  3.4 讨论  49-50
  3.5 本章小结  50-51
第四章 Acidiphilium cryptum DX1-1(UV60-3)胞内蛋白在环境诱导下的表达差异  51-63
  4.1 实验仪器和材料  51
  4.2 主要方法  51-53
    4.2.1 2-D电泳  51
    4.2.2 凝胶图像分析  51-52
    4.2.3 差异蛋白点的质谱分析  52-53
  4.3 结果与分析  53-60
    4.3.1 胞内蛋白差异表达图谱  53-54
    4.3.2 胞内蛋白差异表达分析取点  54-55
    4.3.3 质谱分析结果  55-60
  4.4 讨论  60-62
  4.5 本章小结  62-63
第五章 总结  63-64
参考文献  64-71
致谢  71-72
攻读学位期间主要的研究成果  72

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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