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HO-1对香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞凋亡及CHOP表达的调节作用

作　者: 张立
导　师: 罗百灵
学　校: 中南大学
专　业: 呼吸内科
关键词: 正常人支气管上皮细胞慢性阻塞性肺疾病香烟烟雾提取物血红素加氧酶-1 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景和目的：慢性阻塞性肺疾病(COPD)最重要的病理特征是慢性支气管炎和肺气肿,其中最突出的病理变化是支气管上皮屏障功能的丧失,上皮细胞的变性、死亡和脱落。内质网应激(ESR)所介导的细胞凋亡途径是一条除传统死亡受体途径(外源性途径)及线粒体途径(内源性途径)以外的新的细胞凋亡途径。生长阻滞和DNA损伤诱导基因153即CHOP/GADD153(CATT/增强子结合蛋白同源蛋白)在内质网应激时可被诱导表达,CHOP可通过阻滞细胞分裂周期而促进细胞凋亡。在非应激时,表达量较低,而在ESR中,其表达量大大增加,在内质网应激中CHOP是一个由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子。CHOP在ESR诱导的细胞凋亡途径中发挥促凋亡作用。血红素加氧酶-1(HO-1)是一种广泛存在的抗氧化防御酶,除了可被其底物血红素诱导外,在病理条件下可被多种伤害性刺激诱导而产生高水平的表达,具有抗炎、抗凋亡、抗增生及抗氧化的效应,在许多疾病如支气管哮喘、肺纤维化、心脏及肺的缺血再灌注损伤等中起到细胞保护作用。吸烟是COPD重要的病因,香烟烟雾中含有多种毒性成分和氧自由基,可以诱导人支气管上皮细胞发生内质网应激并诱导细胞凋亡。在此过程中,HO-1可能通过下调CHOP的表达,进而提高细胞抵抗内质网应激所诱导的细胞凋亡作用。本研究拟用香烟烟雾提取物(CSE)干预的人支气管上皮细胞(NHBE cells)为主要模型,检测香烟烟雾提取物对正常人支气管上皮细胞促凋亡转录因子CHOP表达水平的影响；并观测HO-1在此过程中的抗凋亡的作用,以及可否通过诱导HO-1的表达下调CHOP的表达,增加细胞抗凋亡和抵抗内质网应激的能力,为COPD的临床治疗寻求更多实验依据。方法：实验分四组：CSE组,CSE+HO-1诱导剂(血晶素)组,CSE+HO-1抑制剂(锌原卟啉)组,空白对照组。体外培育NHBE细胞并分别给予CSE及HO-1诱导剂及HO-1抑制剂处理。采用Western blot法检测CHOP及HO-1蛋白水平,Hoechest33258染色观察细胞形态学改变及流式细胞学检测凋亡率。结果：1.在CSE组,CSE+HO-1诱导剂组,CSE+HO-1抑制剂组中,CSE组及CSE+HO-1诱导剂组中检测HO-1蛋白均有显著表达；加入HO-1诱导剂的细胞干预组,HO—1表达较CSE+HO-1抑制剂组及CSE干预组及空白对照组明显增高(P<0.05)。2.在空白对照组、CSE+HO-1诱导剂组、CSE组、CSE+HO-1抑制剂组中CHOP的表达依次增高。3.CSE干预的CSE组、CSE+HO-1诱导剂组及CSE+HO-1抑制剂组三组细胞均出现典型的凋亡特征,予以Hoechst33258进行细胞核染色显示CSE组、CSE+HO-1诱导剂组及CSE+HO-1抑制剂组细胞核呈现浓染、颗粒块状荧光及明显的形态裂化。流式细胞学检测示细胞凋亡率较空白对照组显著增加(P<0.05)。CSE+HO-1抑制剂组、CSE干预组、CSE+HO-1诱导剂组、空白对照组、流式细胞学检测的凋亡率依次为：20.85±1.63%、12.73±1.48%、6.09±1.39%、0.88±0.42%,细胞凋亡率依次递减(P<0.05),而CHOP的表达与其具有一致性。结论：1.CSE能使NHBE细胞发生凋亡,并呈时间浓度依赖性。2.CHOP参与了香烟烟雾提取物(CSE)诱导离体的人支气管上皮(NHBE cells)细胞发生内质网应激所致的细胞凋亡。3.HO-1的高表达可抑制香烟烟雾诱导的支气管上皮细胞凋亡,这种作用可能是通过抑制CHOP的表达而达到的。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
英文缩略词表  12-13
第一章前言  13-15
第二章材料与方法  15-28
  2.1 材料  15-20
    2.1.1 细胞系及细胞培养所用的材料  15
    2.1.2 对细胞干预所需的试剂及材料  15
    2.1.3 实验主要试剂及来源  15-16
    2.1.4 主要实验用溶液配制  16-20
    2.1.5 主要仪器  20
  2.2 方法  20-27
    2.2.1 实验细胞培养  20-21
    2.2.2 MTT方法确定烟草提取物CSE处理NHBE的使用时间及浓度  21-22
    2.2.3 细胞分组  22
    2.2.4 Western blot检测NHBE细胞中CHOP、HO-1蛋白表达  22-26
    2.2.5 流式细胞学检测细胞凋亡  26
    2.2.6 Hoechst33258单染法检测细胞凋亡  26-27
  2.3 统计学分析  27-28
第三章结果  28-33
  3.1 MTT方法确定烟草提取物CSE处理NHBE的使用时间及浓度  28-29
  3.2 Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞核形态学变化  29-30
  3.3 流式细胞学方法检测细胞凋亡  30-31
  3.4 Western blot检测NHBE细胞中CHOP、HO-1蛋白表达  31-33
第四章讨论  33-38
第五章结论  38-39
参考文献  39-44
综述  44-53
  参考文献  49-53
致谢  53

HO-1对香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞凋亡及CHOP表达的调节作用

内容摘要

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