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小分子化合物bis-N-norgliovictin调控TLR4信号通路的研究
作 者: 宋玉仙
导 师: 侯亚义
学 校: 南京大学
专 业: 药理学
关键词: bis-N-norgliovictin Toll样受体4 炎症 MyD88 TRIF
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)在哺乳动物的免疫系统中发挥着会重要作用。它们识别不同的微生物进而激活天然免疫和获得性免疫系统,控制机体的免疫反应。其中TLR4介导的免疫反应的异常活化与许多难治性疾病(如:肿瘤、病毒感染、自身免疫病等)的发生发展密切相关,而临床上针对这一通路的治疗药物非常有限。因此,发现新的调控TLR4信号通路的小分子化合物,并深入研究其调控特点与机制,将有可能开发出新的药物,为这些疾病的治疗带来新的希望。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是TLR4最典型的配体,能激活TLR4信号通路,产生大量炎性因子。于是我们建立了LPS诱导的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7模型,通过流式细胞术胞内因子检测的方法,从一系列海洋来源的共生菌产物中筛选能抑制该模型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的小分子化合物。我们筛选出几个化合物能抑制TNF-α和MCP-1的表达,其中化合物bis-N-norgliovictin(来自海洋真菌的二酮哌嗪类化合物)效果最明显。基于此,我们对bis-N-norgliovictin抗炎作用的特点和机制进行了进一步探索。首先,我们用CCK-8试剂检测细胞活力,发现bis-N-norgliovictin (0.5~16μg/ml)对RAW264.7细胞的活力无影响,说明bis-N-norgliovictin的抗炎作用与其细胞毒性无关;接着,用ELISA或流式细胞术分析不同浓度bis-N-norgliovictin (0.5、1、2μg/ml)对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β产生的影响。结果显示,bis-N-norgliovictin对这些炎性因子均有不同程度的抑制作用;荧光定量PCR分析结果表明,bis-N-norgliovictin剂量依赖性地抑制炎性炎性因子mRNA的表达水平;同时,我们还发现bis-N-norgliovictin对小鼠腹腔巨噬细胞和LPS诱导的小鼠炎症模型具有类似的抗炎作用。流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞对FITC-LPS的结合和内吞能力,发现bis-N-norgliovictin (0.5、2μg/ml)对其并无影响,说明,bis-N-norgliovictin不改变巨噬细胞的信号识别和吞噬功能。TLR4诱导两条不同的信号通路,分别由MyD88和TRIF来介导。其中MyD88依赖的信号通路主要经过MAPKs和NF-κB,最终产生致炎因子(如TNF-α、IL-6); TRIF依赖的信号通路除上述MAPKs和NF-κB外,还经过干扰素调节因子3(IRF3),最终产生Ⅰ型干扰素和干扰素诱导基因(如IFN-β、IP-10)。上述实验结果已表明,bis-N-norgliovictin对MyD88和TRIF依赖的两条通路的产物都有抑制作用,这就提示我们,该化合物可能对这两条通路都起调控作用。接下来我们从这两条通路出发研究bis-N-norgliovictin的作用机制。用Western Blot法分析RAW264.7细胞NF-κB上游IκBα的磷酸化水平和降解情况,结果显示,bis-N-norgliovictin (2μg/ml)能显著下调LPS诱导的IκBα的磷酸化和降解水平;免疫荧光法观察到bis-N-norgliovictin减少LPS诱导的NF-κB的入核;同时,bis-N-norgliovictin能显著抑制LPS诱导的MAPKs中JNK和p38的磷酸化,而对ERK的磷酸化几乎不影响;荧光报告基因检测发现,bis-N-norgliovictin降低LPS诱导的AP-1的活性;另一方面,bis-N-norgliovictin对LPS诱导的RAW264.7细胞IRF3的磷酸化也起一定的抑制作用。综上所述,筛选出的小分子化合物bis-N-norgliovictin能有效抑制TLR4介导的巨噬细胞炎症通路的活化,对TLR4通路中MyD88和TRIF两条途径均有下调作用。所有结果提示,bis-N-norgliovictin是一个新的TLR4通路的小分子抑制剂,它有可能成为治疗TLR4相关疾病的候选化合物。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-9 目录 9-12 缩略词表 12-14 前言 14-16 第一章 TLR4信号通路研究进展 16-21 1.1 LPS-TLR4信号通路 16-18 1.1.1 MyD88依赖的信号通路 16-17 1.1.2 TRIF依赖的信号通路 17-18 1.2 TLR4通路抑制剂研究进展 18-21 1.2.1 TLR4信号通路的内源性抑制剂 18-19 1.2.2 TLR4信号通路的外源性抑制剂 19-21 第二章 基于TLR4通路的小分子化合物的筛选 21-27 2.1 引言 21 2.2 实验材料 21-22 2.2.1 实验对象 21 2.2.2 主要试剂 21 2.2.3 主要仪器和设备 21-22 2.3 实验方法 22-23 2.3.1 小分子化合物溶液配置 22 2.3.2 细胞培养 22 2.3.3 流式细胞术检测胞内细胞因子水平 22-23 2.3.4 数据统计分析 23 2.4 实验结果与分析 23-26 2.4.1 LPS对RAW264.7细胞形态及炎性因子产生的影响 23-24 2.4.2 小分子化合物筛选结果 24-26 2.5 讨论 26-27 第三章 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的炎性因子的产生 27-40 3.1 引言 27 3.2 实验材料 27-28 3.2.1 实验对象 27 3.2.2 主要试剂 27-28 3.2.3 主要仪器设备 28 3.3 实验方法 28-31 3.3.1 CCK-8法检测细胞活力 28 3.3.2 小鼠腹腔巨噬细胞的获取与鉴定 28-29 3.3.3 ELISA法或流式细胞术检测炎性因子蛋白水平 29 3.3.4 荧光定量PCR分析炎性因子mRNA水平 29-30 3.3.5 在体实验 30-31 3.3.6 数据统计分析 31 3.4 实验结果与分析 31-38 3.4.1 Bis-N-norgliovictin不影响巨噬细胞的细胞活力 31-32 3.4.2 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的产生 32-33 3.4.3 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的炎性因子mRNA水平 33-34 3.4.4 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞炎性因子的产生 34-37 3.4.5 Bis-N-norgliovictin抑制LPS诱导的小鼠血清炎性因子水平 37-38 3.5 讨论 38-40 第四章 Bis-N-norgliovictin对TLR4信号通路的调控作用 40-51 4.1 引言 40 4.2 实验材料 40-41 4.2.1 实验对象 40 4.2.2 主要试剂 40-41 4.2.3 主要仪器设备 41 4.3 实验方法 41-44 4.3.1 流式细胞术检测细胞对FITC-LPS的结合与内吞 41 4.3.2 Western bolt 41-42 4.3.3 免疫荧光法观察NF-κB核转位 42 4.3.4 质粒提取 42-43 4.3.5 质粒转染 43 4.3.6 荧光报告基因检测 43-44 4.3.7 数据统计分析 44 4.4 实验结果与分析 44-49 4.4.1 Bis-N-norgliovictin不影响LPS的结合与内吞 44-45 4.4.2 Bis-N-norgliovictin抑制NF-κB信号通路 45-47 4.4.3 Bis-N-norgliovictin选择性抑制MAPK信号通路 47-48 4.4.4 Bis-N-norgliovictin抑制IRF3信号通路 48-49 4.5 讨论 49-51 结论 51-52 参考文献 52-59 附录 59-62 硕士期间科研成果 62-63 致谢 63-64
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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