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DFP对慢性铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的调节机制的研究

作　者: 李红彦
导　师: 刘萍
学　校: 山东大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮铝中毒氨基酸类神经递质保护作用
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【目的】铝在自然界中广泛存在,由于其具有良好的理化特性,普遍应用于工业、医药和日常生活中,人们接触铝的机会大大增加,主要通过食品添加剂、含铝药物、铝制炊具和其他铝制品摄入体内。研究表明,铝是一种慢性蓄积性神经毒物,长期接触铝可引起学习记忆功能减退、认知功能障碍等痴呆症状,过量的铝蓄积可产生神经毒性,引起神经退行性病变,铝在Alzheimer型老年性痴呆、透析性痴呆等疾病中发挥的毒性作用已得到许多学者的肯定。脑内氨基酸类神经递质按其功能分为兴奋性氨基酸类神经递质和抑制性氨基酸类神经递质,谷氨酸（Glu）和天门冬氨（Asp）为兴奋性神经递质,甘氨酸（G1y）和γ-氨基丁酸（GABA）为抑制性神经递质,研究表明,氨基酸类神经递质含量的改变与神经退行性变、脑损伤、学习记忆密切相关。目前,临床上大多使用铝螯合剂治疗由于铝负荷过多引起的疾病,本研究将1,2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮（DFP）作为一种新型铝螯合剂,以Wistar大鼠为研究对象,建立脑组织中氨基酸类神经递质测定的高效液相色谱法,通过研究DFP对铝染毒大鼠的学习记忆能力、脑组织中氨基酸类神经递质的含量及脑组织病理损伤的恢复和改善作用,来评价DFP对大鼠中枢神经系统的保护作用,同时通过测定大鼠脑组织中铝和其它必需元素含量,探讨DFP排铝作用及对其它必需元素的影响。【方法】1实验动物模型的建立健康雄性Wistar大鼠35只,体重180-220g,自由饮水和进食,按体重随机分成5个组,即阴性对照组,铝染毒组,DFP+低剂量组,DFP+中剂量组,DFP+高剂量组,均以灌胃方式给药。除阴性对照组外其余各组均给予AlCl₃溶液进行染毒,染毒8周后,阴性对照组、铝染毒组给予生理盐水2周,DFP低、中、高剂量组给予DFP2周。2 DFP对铝染毒大鼠学习记忆能力的改善实验结束前两天,进行大鼠迷宫实验,观察DFP对铝染毒大鼠学习记忆能力的改善情况。3大鼠脑组织中氨基酸类神经递质测定的方法学研究采用丹酰氯柱前衍生,高效液相色谱一紫外检测法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的含量。色谱条件:大连依利特Hypersil-2 C₁₈（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱;流动相:A:甲醇,B:四氢呋喃.甲醇-0.05mol/L醋酸钠（V:V:V=1:15:84）,梯度洗脱,流速:0.6ml.min^-1;紫外检测器,波长为254nm;进样量:20μl。4 DFP对铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响给药结束后,断头处死大鼠,分离并准确称取一定量脑组织,按比例加入生理盐水,冰浴中充分匀浆,甲醇沉淀蛋白,离心,取上清液加入100μl 2mol/LKHCO₃溶液,200μl丹酰氯-丙酮（4g/L）,混匀,80℃水浴,暗中反应40min,取出后加入200μl 0.1mol/L的盐酸溶液停止反应,冷却后20μl进样,高效液相色谱-紫外检测法测定脑组织中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸四种氨基酸类神经递质的含量。5 DFP对铝染毒大鼠脑组织中排铝作用的研究取各组大鼠脑组织,称重,用微波消解仪消化后,石墨炉原子吸收分光光度法测定脑组织中铝含量,观察DFP的排铝效果。6 DFP对铝染毒大鼠脑组织中其它必需元素的影响取各组大鼠脑组织,称重,用微波消解仪消化后,火焰原子吸收分光光度法测定大鼠脑组织中的铜、锌、钙、铁、镁含量,研究DFP对铝染毒大鼠脑组织中必需元素的影响。7 DFP对铝致脑组织损伤恢复的形态学观察取各组大鼠脑组织,苏木素.伊红染色（HE）染色,进行病理学观察,观察铝对大鼠中枢神经系统的病理形态学改变及DFP对其恢复作用。【结果】1 DFP对铝染毒大鼠学习记忆能力的改善大鼠迷宫实验中,铝染毒组大鼠全天总反应时间（TRT）明显高于阴性对照组（P＜0.01）,低剂量组高于阴性对照组（P＜0.05）,中剂量组与高剂量组与阴性对照组比较差异均无统计学意义,低、中、高剂量组显著低于铝染毒组（P＜0.01）;铝染毒组与低剂量组大鼠错误次数显著多于阴性对照组（P＜0.01）,低、中、高剂量组均显著少于铝染毒组（P＜0.01）,中剂量组与高剂量组与阴性对照组比较差异无统计学意义。2高效液相色谱测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的方法学研究在给定的条件下,大鼠脑组织中四种氨基酸在35min内分离完全且分离良好,保留时间分别为天门冬氨酸（10.48min）、谷氨酸（11.92min）、甘氨酸（30.76min）、γ-氨基丁酸（33.45min）;四种氨基酸在20～200μg/ml范围内,线性关系良好（r≥0.999）;天门冬氨酸最低检出浓度为1.5×10^-3mg/L,加标回收率为84.1%～108.8%,日内精密度RSD为0.52%～2.90%,日间精密度RSD为1.60%～4.66%;谷氨酸最低检出浓度为1.8×10^-3mg/L,加标回收率为82.4%～109.2%,日内精密度RSD为1.23%～2.37%,日间精密度RSD为3.04%～5.43%:甘氨酸最低检出浓度为0.3×10^-3mg/L,加标回收率为87.1%～109%,日内精密度RSD为1.01%～3.15%,日间精密度RSD为1.23%～4.87%;γ-氨基丁酸最低检出浓度为0.5×10^-3mg/L,加标回收率为83.1%～104.9%,日内精密度RSD为0.72%～3.84%,日间精密度RSD为1.60%～5.76%。3 DFP对铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响铝染毒组大鼠脑组织中兴奋性氨基酸类神经递质天门冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的含量显著低于阴性对照组（P＜0.01）,低、中、高剂量组均高于铝染毒组（P＜0.01）,但仍低于阴性对照组（P＜0.01）。铝染毒组大鼠脑组织中抑制性氨基酸类神经递质甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（GABA）的含量显著高于阴性对照组（P＜0.01）,低、中、高剂量组均低于铝染毒组（P＜0.01）,但仍高于阴性对照组（P＜0.01）。4 DFP对铝染毒大鼠脑组织中铝的排出作用铝染毒组大鼠血清铝含量明显高于阴性对照组,差异具有显著性（P＜0.01）,高剂量组明显低于铝染毒组（P＜0.01）,但各给药组尚高于阴性对照组（P＜0.01）;铝染毒组大鼠脑铝含量高于阴性对照组（P＜0.01）,低、中、高剂量组脑铝含量低于铝染毒组（P＜0.01）,高剂量组与阴性对照组比较,差异无统计学意义。5 DFP对铝染毒大鼠脑组织中其它必需元素的影响铝染毒组大鼠脑组织中锌含量显著高于阴性对照组（P＜0.05）,其它各组与阴性对照组及铝染毒组相比较差异均无统计学意义;各组大鼠脑组织中铜、铁、钙、镁的含量比较差异无统计学意义。6 DFP对铝致大鼠脑组织损伤恢复的形态学观察铝染毒组大鼠脑组织有明显的病理改变,各剂量组与铝染毒组相比神经元细胞基本正常;各剂量组中,高剂量组恢复情况较好,基本恢复到正常。【结论】1 DFP能够有效地改善铝染毒大鼠的学习记忆能力。2本研究建立的高效液相色谱测定脑组织中氨基酸类神经递质含量的方法具有快速、准确、灵敏、样品制备简便等优点,能够有效地分离、测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的含量。3 DFP能够升高铝染毒大鼠脑组织中兴奋性氨基酸类神经递质的含量,降低抑制性氨基酸类神经递质的含量,对中枢神经系统有明显的保护作用。4 DFP排铝效果显著,同时对其它必需元素锌、镁、钙、铜、铁均无促排作用。5 DFP对铝蓄积引起的脑组织病理损害有一定的保护作用。

全文目录

中文摘要  6-10
英文摘要  10-15
符号说明  15-16
前言  16-21
材料与方法  21-29
结果  29-39
讨论  39-57
结论  57-58
附图  58-61
参考文献  61-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的论文  72-73
附件二:学位论文评阅及答辩情况表  73

DFP对慢性铝染毒大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的调节机制的研究

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