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血管紧张素Ⅱ对人近端肾小管细胞衔接蛋白p66Shc表达及磷酸化的影响

作　者: 陈文萃
导　师: 孙林
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 血管紧张素II 衔接蛋白p66Shc 人近端肾小管细胞 db/db小鼠
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究背景:糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）是糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）最常见、最严重的微血管并发症,是引起糖尿病人死亡最主要的原因。在DN的发病机制中,氧化应激引起线粒体产生大量ROS是DN发病的关键机制和中心环节。以往研究认为,DN的病理损害主要在肾小球,最新研究发现,2型糖尿病的主要病理特征之一是肾小管细胞的氧化损伤,肾小管的氧化损伤不是继发于肾小球损伤,而是DN的早期原发损伤。肾素-血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System,RAS）在肾脏生理及病理生理过程中有十分重要的作用,血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）是该系统最重要的效应分子。大量研究证明,AngⅡ是促进肾脏疾病发生发展的关键因素,它可以诱导线粒体ROS产生,引起细胞的氧化损伤。最近研究发现,衔接蛋白p66Shc表达上调能够引起线粒体ROS产生增加,加重细胞的氧化损伤,并且与第36位丝氨酸（Ser36）的磷酸化密切相关。目前,关于衔接蛋白p66Shc在糖尿病肾病肾组织的表达情况及AngⅡ是否能影响肾小管细胞衔接蛋白p66Shc的表达与磷酸化国内外尚未见报道。目的:观察衔接蛋白p66Shc在db/db小鼠肾组织的表达情况;研究AngⅡ对人近端肾小管细胞（HK-2）p66Shc表达及磷酸化的影响。方法:1、2型糖尿病db/db小鼠及对照组db/m小鼠各4只,在14周龄时处死,取肾脏组织,常规HE及Masson染色观察两组病理学变化;并进行免疫组化及Western Blot检测两组小鼠肾组织中p66Shc蛋白的表达情况。2、常规培养HK-2细胞,以不同浓度AngⅡ刺激24h,Real TimePCR及Western Blot分别从基因及蛋白水平检测AngⅡ对HK-2细胞p66Shc表达的影响。以高浓度AngⅡ刺激HK-2细胞,Western Blot检测不同时间点p66Shc Ser36磷酸化水平的变化。结果:1、体内实验:HE和Masson染色显示,与db/m小鼠比较,db/db小鼠肾小球肥大,细胞数增多,系膜区增生,部分小管可见空泡变性及上皮细胞脱落,小管萎缩不明显;免疫组化显示,与db/m小鼠比较,p66Shc蛋白主要在db/db小鼠肾小管表达增加（P＜0.05）;WesternBlot显示,与db/m小鼠比较,db/db小鼠肾组织p66Shc蛋白表达明显增加（P＜0.01）。2、体外实验:与对照组比较,当AngⅡ浓度在10-4μM及以上时,p66Shc mRNA及蛋白表达明显增加,且呈剂量依赖性（P＜0.01）;与对照组比较,Western Blot显示浓度为1μM的AngⅡ刺激10min就能引起HK-2细胞p66Shc Ser36磷酸化水平上升,在30min明显增加,在60min达到峰值,之后磷酸化水平逐渐下降,但仍处于较高水平（P＜0.01）。结论:1、衔接蛋白p66Shc主要在糖尿病肾病小鼠肾小管细胞中表达增高。2、血管紧张素Ⅱ诱导人近端肾小管细胞p66Shc表达上调,且呈剂量依赖性。3、高浓度血管紧张素Ⅱ诱导人近端肾小管细胞衔接蛋白p66Shc第36位丝氨酸磷酸化水平升高。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
英文缩略词简表  9-10
论文正文  10-43
  第一章 前言  10-13
  第二章 p66Shc蛋白在db/db小鼠肾脏的表达情况  13-23
    2.1 材料与方法  13-18
      2.1.1 材料  13-14
      2.1.2 实验方法  14-18
      2.1.3 统计学处理  18
    2.2 实验结果  18-21
      2.2.1 db/db及db/m小鼠的一般情况  18
      2.2.2 db/db小鼠肾脏组织形态学改变  18-19
      2.2.3.p66Shc在db/db小鼠肾脏的表达情况  19-21
    2.3 讨论  21-22
    2.4 小结  22-23
  第三章 Ang Ⅱ对人近端肾小管细胞p66Shc蛋白表达的影响  23-36
    3.1 材料与方法  23-28
      3.1.1 材料  23-24
      3.1.2 实验方法  24-28
      3.1.3 统计学处理  28
    3.2 实验结果  28-32
      3.2.1 人近端肾小管细胞(HK-2)的形态学观察  28
      3.2.2 细胞总RNA的质量的检测  28-29
      3.2.3 Ang Ⅱ诱导人近端肾小管细胞p66Shc mRNA表达上调  29-30
      3.2.4 Ang Ⅱ诱导人近端肾小管细胞p66Shc蛋白表达增加  30-31
      3.2.5 Ang Ⅱ诱导人近端肾小管细胞p66Shc蛋白的磷酸化  31-32
    3.3 讨论  32-35
    3.4 小结  35-36
  第四章 全文总结  36-37
  参考文献  37-43
综述  43-50
致谢  50-51
攻读学位期间的主要研究成果  51

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病性昏迷及其他并发症
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