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文蛤病原菌（需钠弧菌）的分离鉴定与免疫防治技术研究

作　者: 李国
导　师: 常维山
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 文蛤需钠弧菌 16S rRNA 系统发育树微生态制剂芽孢杆菌非特异性免疫因子相对免疫保护率
分类号: S944
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

弧菌(vibrio)是海洋环境中最常见的细菌类群之一,广泛分布于近岸、河口海区的海水和生物体中,其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大,是海水养殖动物的主要病原菌之一。危害的对象包括鱼类、甲壳类和贝类动物,给我国的海水养殖事业带来了很大的损失。预防与控制海水养殖动物弧菌病的发生,加强弧菌病的研究,对海水养殖业可持续发展具有重要的意义。文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我国沿海常见的一种重要经济贝类,是出口创汇的重要水产品之一。近年来,随着养殖规模的扩大,由于养殖水域水质环境恶化和各种疾病的流行而引发的养殖文蛤的大规模死亡已造成巨大的经济损失,因此,预防与控制养殖文蛤病害的发生,加强文蛤疾病的研究,已经成为保障文蛤养殖业健康发展的当务之急。本实验从患病文蛤体内分离出一优势菌株WT01,回归感染试验证明是文蛤的致病菌,对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和pH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明,该菌为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖产酸不产气,氧化酶阳性,生长需NaCl,无色素,不发光,在TCBS平板上形成圆形黄色菌落,对弧菌抑制剂O/129敏感,具有弧菌属的典型特征。16S rRNA基因序列分析表明,该菌与需钠弧菌(Vibrio natriegen)的亲缘关系最为接近,其同源性达99%以上,因此将该菌鉴定为需钠弧菌,病原菌对文蛤的半数致死量为5.5×106CFU/mL,在温度10℃-42℃、PH值5-11、盐度5‰-80‰的环境条件下都能生长。药敏试验结果表明,该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素、庆大霉素等抗生素较为敏感。微生态制剂(microecologics)具有防治疾病、促进生长、增加体重等多种功能,且无污染、无残留、不产生抗药性。不仅可以改善养殖水域环境,还可以提高养殖对象的机体免疫力,减少病害的发生,因此具有广泛的应用前景。本研究在实验生态条件下,观察浓度分别为1×105cfu/L、1×106cfu/L和1×107cfu/L的微生态制剂(主要成分为芽孢杆菌)对文蛤暴露后第1d、3d、7d、21d、28d和恢复14d后对文蛤消化腺中的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶活力(SOD活力)和过氧化氢酶活力(CAT活力)的影响,确定微生态制剂对文蛤非特异性免疫力的影响;用需钠弧菌对诱导28d后的文蛤进行攻毒实验,测定相对免疫保护率,以确定微生态制剂对文蛤抗病力的影响。结果表明,各浓度组的微生态制剂均能显著提高文蛤非特异性免疫因子的活力,对消化腺抗菌活力和SOD活力的促进作用尤为显著,且不同浓度试验组之间的免疫因子活力也有显著差异。与对照组相比,溶菌活力和CAT活力在第7d就出现显著性增高,抗菌活力和SOD活力在第14d与对照组出现显著性差异;恢复14d后,溶菌活力和SOD活力恢复到对照组相当的水平,抗菌活力和CAT活力仍明显高于对照组。攻毒试验结果显示,试验组的免疫保护率分别达到22.2%、27.8%和44.4%。表明所用微生态制剂可以促进文蛤的非特异性免疫功能。通过对水质的测定,证实使用微生态制剂对降低水中的氨氮含量、亚硝酸盐含量和化学耗氧量的效果显著。

全文目录

英文缩略及细菌英文名列表  8-10
中文摘要  10-12
Abstract  12-14
引言  14-16
第一章文献综述  16-27
  1 弧菌及弧菌病  16-18
  2 弧菌的致病机理  18-19
  3 对主要养殖贝类的危害  19-22
    3.1 鲍  19-20
    3.2 蛤类  20-21
    3.3 扇贝  21-22
    3.4 牡蛎  22
  4 养殖贝类弧菌病的防治  22-25
    4.1 药物防治  22-23
    4.2 免疫学和生态学防治  23-24
    4.3 良种培育提高抗病力  24
    4.4 改善养殖环境，优化养殖模式  24-25
  5 研究目的和意义  25-27
第二章文蛤病原菌（需钠弧菌）的分离和鉴定  27-41
  1 材料与方法  27-30
    1.1 病原菌的分离  27-28
    1.2 人工感染和半数致死量 LD50的测定  28
    1.3 病原菌的再分离和生理生化特征鉴定  28
    1.4 细菌最适生长温度、盐度和pH值的测定  28
    1.5 16S rRNA基因序列分析  28-29
      1.5.1 PCR模板DNA的制备  28-29
      1.5.2 16S rRNA扩增与测序  29
    1.6 序列分析及系统发育树的构建  29
    1.7 溶血性测定和药敏试验  29-30
  2 结果  30-39
    2.1 病原菌分离及人工感染  30-31
    2.2 形态和生理生化特征  31-34
    2.3 细菌最适生长温度、盐度和pH值  34-36
    2.4 16S rRNA 基因序列和系统发育学分析  36-37
    2.5 溶血性和药敏结果  37-39
  3 讨论  39-41
第三章微生态制剂对文蛤非特异性免疫因子影响的研究  41-50
  1 材料与方法  41-44
    1.1 试验材料  41
    1.2 试验分组及饲养管理  41-42
    1.3 取样和样品的预处理  42
    1.4 测定方法  42-43
      1.4.1 抗菌活力测定  42
      1.4.2 溶菌活力的测定  42-43
      1.4.3 CAT和SOD活力测定  43
    1.5 攻毒试验  43
    1.6 数据分析  43-44
  2 结果  44-48
    2.1 溶菌活力的测定结果  44
    2.2 抗菌活力的测定结果  44-45
    2.3 抗氧化酶活力的测定结果  45-47
      2.3.1 CAT活力测定结果  45-46
      2.3.2 SOD活力测定结果  46-47
    2.4 攻毒实验结果  47-48
  3 讨论  48-50
第四章微生态制剂对文蛤养殖水体水质条件的影响  50-56
  1 材料与方法  50-51
    1.1 试验材料  50
    1.2 试验分组及饲养管理  50-51
    1.3 水样采集及测定方法  51
  2 结果  51-53
    2.1 微生态制剂对水中氨氮的影响  51-52
    2.2 微生态制剂对水中亚硝酸盐的影响  52
    2.3 微生态制剂对水中化学耗氧量的影响  52-53
    2.4 微生态制剂对水中溶解氧的影响  53
  3 讨论  53-56
结论  56-57
结束语  57-58
参考文献  58-68
试验所需培养基配方及测定方法  68-71
个人简介  71-72
攻读硕士学位期间发表论文情况  72-73
致谢  73

文蛤病原菌（需钠弧菌）的分离鉴定与免疫防治技术研究

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