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体外诱导获得雪旺氏细胞的可靠性研究

作　者: 闫中杰
导　师: 徐如祥
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经外科
关键词: 雪旺氏细胞 骨髓基质细胞 细胞分化
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


一、目的和意义脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种严重的神经系统创伤。随着社会的进步,主要由交通事故和坠落伤引起的脊柱骨折所致的SCI有逐年上升的趋势。SCI给家庭、社会均带来沉重的负担。传统观念认为哺乳动物的脑和脊髓损伤后不能再生,脊髓损伤后功能恢复的希望渺茫。但近年来的实验研究证实,中枢神经损伤后具有一定的再生能力,随后人们逐渐认识到中枢神经系统再生能力有限主要是因为局部微环境不适宜。SCI修复面临的主要问题是:（1）形成的脊髓空洞、胶质瘢痕成为阻碍轴突生长的机械屏障;（2）原发和继发的神经元凋亡,使脊髓缺乏自我修复能力;（3）神经营养因子缺乏;（4）损伤局部存在抑制轴突再生的因素如Nogo、髓磷脂相关糖蛋白等。近年来,细胞移植在实验性SCI的治疗中显示了良好的效果,给SCI的治疗带来了新的希望。细胞移植可以通过改变SCI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复,主要包括:（1）移植物可填充损伤部位并形成细胞桥,从而为损伤轴突的再生提供机械或生物通道;（2）分泌生长因子,为轴突或神经元再生提供必要条件;（3）替代或提供新的神经元从而形成新的神经环路。由于细胞移植能通过自身的桥接作用恢复严重脊髓损伤所造成的组织缺损,同时提供轴突再生所需要的神经营养因子、细胞外基质和黏附因子,该方法在大量的实验研究中被采用。目前细胞移植研究较多应用的有雪旺氏细胞（Schwann cell,SCs）、嗅鞘细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞及脐血干细胞等。SCs作为外周神经系统中特有的神经胶质细胞,它起源于神经脊（neuralcrest）,随神经轴突的生长而同步增殖和迁移,并包绕有髓神经纤维形成髓鞘,从而支持和营养神经纤维。在有髓神经纤维中,一个SCs包绕一根轴突;而在无髓神经纤维中一个SCs可包绕多根轴突。SCs具有同质性（homogeneous）,即不同部位SCs的细胞学特性基本相同。当神经轴突受到损伤时,产生华勒氏变性（Wallerian degeneration）,损伤远端的SCs大量增殖并包绕再生轴突,完成髓鞘化后修复损伤的神经轴突。SCs作为神经系统损伤最重要的组织工程种子细胞之一,在神经系统损伤修复研究中起着重要作用。尽管SCs是外周神经的主要结构和功能细胞,对神经再生和功能的恢复起着重要作用。但SCs属于终末细胞,难以进行有丝分裂,很难获得足够的雪旺细胞,又由于其具有抗原性,因此限制了其在外周神经和中枢神经系统中的修复和治疗过程中的应用。2001年Dezawa等采用骨髓基质细胞（bone marrow stromalcells,BMSCs）在体外诱导分化为雪旺氏细胞样细胞。这种诱导得到的细胞（differentiated bone marrow stromal cells,dBMSCs）表达雪旺氏细胞的特异表面蛋白p75、S100、GFAP。但dBMSCs和外周神经来源的SCs形态上并不完全一致,其诱导完成后的细胞生长、增值能力和能否保持诱导后状态以及分泌神经营养因子的能力等情况尚未有文献报道。本实验以SCs为阳性对照通过对体外诱导大鼠BMSCs向SCs方向转化的各个阶段进行了相关指标的检测,并对诱导后所得细胞相关性能的稳定性进行了评定。二、方法本实验分为两部分:第一部分:骨髓基质细胞、雪旺氏细胞的分离培养及诱导2.1.1.骨髓基质细胞的分离培养取成年SD大鼠体重（200～250g）,以3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉,无菌条件下取双侧股骨和胫骨,用含10mlαMEM培养基的无菌注射器冲洗骨髓腔,用吸管将骨髓组织悬液吹打均匀,离心后以含10%FBS的完全培养液重悬,接种于25cm2培养瓶,37℃、5%CO2、湿度95%条件下培养。48h后更换培养液,去除未贴壁细胞。以后每隔72h换液,待原代细胞90%融合后以0.25%胰酶消化3分钟行首次传代,传至第四代后进行诱导实验。2.1.2.SCs的培养纯化取新生SD大鼠,乙醚麻醉,无菌条件下取出双侧坐骨神经置于PBS（pH=7.4）液中。在解剖显微镜下仔细剥除神经外膜,清洗后剪成1～2mm3大小组织块,用吸管吹打至组织块成为均匀的絮状物,接种于35mm培养皿中,并加入适量的含10%FBS的DMEM/F12培养液中,使培养液超过组织块,于5%CO2、37℃条件中培养,次日待组织絮状物贴壁,轻轻将培养液加到使用量。每周更换换液2～3次,待从组织块中迁出的细胞基本融合后用吸管吹打细胞,边吹打边用显微镜观察,直至大部分SCs被吹下来,将吹下来的细胞离心后接种至另一培养皿中,反复接种两到三次,此时得到的细胞以SCs为主。取得到纯化后SCs作为阳性对照进行后续的实验。2.1.3.诱导过程主要步骤为:BMSCs达到亚融合后,去除培养液,加入预诱导液1（αMEM培养基含1mmol/L BME）,37℃、5%CO2培养24h。去除预诱导液1,用PBS（pH=7.4）清洗3次,加入预诱导液2（αMEM培养基、10%FBS、35ng/ml RA）。37℃、5%CO2培养72h。去除预诱导液2,用PBS液清洗3次,加入诱导液（αMEM培养基,10%FBS,5μmol/L Forskolin、10ng/ml bFGF、5ng/ml PDGF、200ng/ml HRG）37℃、5%CO2条件下进行诱导,诱导过程中每两天换液一次,共诱导7天。对诱导后的细胞进行传代,观察细胞形态的变化。第二部分:诱导后细胞表面标志及分泌能力的检测2.2.1.细胞免疫化学染色对dBMSCs用PBS冲洗后,于室温条件下在4%多聚甲醛中固定15min。应用一抗S100、P75（兔抗鼠,Chemicon）和GFAP（小鼠抗大鼠,Chemicon）来鉴定诱导后BMSCs的性质。实验所应用的二抗是罗丹明标记的山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（Jackson immunoresearch,US）,应用Hoechst33342复染细胞核。同时对未分化的BMSCs、SCs进行染色分别做为阴性和阳性对照。2.2.2.Real-time PCR检测在诱导过程中,分别取未诱导的BMSCs、诱导后的dBMSCs、诱导后传代细胞和SCs实施Realtime-PCR以检测SCs阳性蛋白S100、p75、CD104的mRNA的表达,使用GAPDH为内参。数据分析:在PCR任意循环中,当荧光强度值大于由仪器自带的软件计算出的阈值（threshold value,CT）时,样本被认为是阳性,样本mRNA表达量差异倍数用2-△△CT来表示（△CT由检测基因的CT值减去内参基因GAPDH的差值,△△CT为每组样品△CT值减去BMSCsCT值得到）,每组取六次标本进行检测。2.2.3.诱导后细胞神经营养因子分泌功能的检测为了评价诱导获得细胞分泌神经营养因子的能力,本实验通过PCR技术对BMSCs、dBMSCs和SCs中的NGF（Nerve Growth Factor）、Ntf-3,NT-3（neurotrophin-3）、BDNF（Brain Derived Grouth Factor）、GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）的mRNA进行了检测。3.结果3.1相差显微镜定位跟踪观察,同一视野下BMSCs诱导过程的形态学变化。在BME的作用下胞体收缩,呈神经元样改变,部分细胞凋亡脱落;RA作用三天后细胞逐渐立体感增强,收缩的胞体重新展开;在复合因子的诱导下,可见部分细胞呈长梭形,突起增长,立体感较强,形似SCs（图1）。3.2诱导前后骨髓基质细胞的形态比较未诱导的BMSCs形态不规则,胞体比较松散,诱导后的BMSCs形态规则,胞体呈现长梭型,形态接近SCs,两端有长的突起。传代后的细胞形态呈成纤维细胞样生长。SCs极性明显,长梭型结构突起长（图2）。3.3诱导前后BMSCs的免疫荧光染色结果未诱导的BMSCs做流式细胞术检测显示CD34-、CD29+、CD45+、CD90+,CD45免疫细胞染色阳性,P75,GFAP和S100呈阴性,SCs免疫荧光提示P75,GFAP和S100呈阳性。诱导后的BMSCs染色结果显示细胞对GFAP和S100抗体呈阳性反应（图3、图4）。3.4p75、CD104、S100的表达量分析Real-time PCR检测对诱导后细胞进行的Realtime-PCR结果显示在诱导结束后CD104 mRNA和S100 mRNA表达量均达到了SCs的表达量水平,传代后其表达量迅速降低接近诱导前细胞水平,甚至低于诱导前细胞水平。P75在诱导结束后mRNA表达量与SCs表达量尚存在较大差距（图5）。3.5NGF、BDNF、GDNF、NT-3表达的PCR测定实验中通过PCR的方法对诱导后细胞表达NGF、BDNF、GDNF、NT-3的能力进行了检测,结果显示未诱导的BMSCs和SCs这几种因子均阳性表达,而诱导后的细胞NT-3表达为阴性表达（图6）。4.结论通过反复贴壁法可得到较纯的BMSCs,利用预诱导,再加复合因子进行诱导后的细胞形态类似雪旺氏细胞,免疫细胞染色和Realtime-PCR结果显示诱导后细胞表达雪旺氏细胞的表面蛋白S100,GFAP,但P75在诱导后的细胞中表达量很低。对各种神经营养因子的检测发现,诱导后的细胞失去了表达NT-3的能力。诱导后的细胞传代培养后细胞形态恢复到BMSCs的细胞形态。5.统计学分析:全部数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差（x±SD）表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析One-way ANOVA,两两比较采用LSD,以P<0.05为差异有统计学意义。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-20
  参考文献  18-20
第一部分 BMSC、SCs的分离培养及诱导  20-33
  材料和方法  20-24
  结果  24-27
  讨论  27-31
  参考文献  31-33
第二部分 dBMSCs表面蛋白及分泌能力的鉴定  33-51
  材料和方法  33-38
  结果  38-43
  讨论  43-48
  参考文献  48-51
全文小结  51-52
缩略语词汇表  52-53
攻读学位期间成果  53-54
生物支架材料在脊髓损伤修复中的应用研究进展  54-63
致谢  63-65
统计学证明  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科学各论 > 头部及神经外科学 > 脊髓
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