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KyoT2病毒载体的构建、Flt3L对单核诱导DC分化成熟的影响

作　者: 牛晓丽
导　师: 梁英民；韩骅
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: notch 慢病毒载体 LIM蛋白/KyoT2 T-ALL 外周血单核细胞 DC Flt3L CD11c CD83 HLA-DR DC成熟
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Notch基因是1919年在果蝇体内被发现的,由于该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch),因此被称为Notch基因。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和无脊椎动物中,在进化上具有高度的保守性。Notch信号在各组织细胞的发育与分化中起着关键性的作用,控制着细胞的命运。其信号传导的变化将导致许多肿瘤的发生。许多血液恶性肿瘤的发生与Notch的过度激活有密切的关系,急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和淋巴瘤就是其中的一种。50%的T-ALL都存在Notch1的突变,这种突变是由于特征性的t(7;9)(q34;q34.3)染色体易位引起的,染色体易位可以导致Notchl蛋白只含有跨膜片段和胞内片段而缺少胞外片段,这种结构的Notchl蛋白及其他类似结构的Notch家族蛋白可以进行跨膜片段的非配体依赖性自发水解并释放游离的Notch胞内片段,即Notch信号通路的不可调控和持续活性,导致靶基因表达的异常。因此,使用Notch受体的γ-分泌酶抑制剂GSI对部分突变的Notchl蛋白是不起作用的。而LIM蛋白KyoT2是通过与Notch1竞争性结合而抑制RBP-J介导的转录激活作用,因此,我们设想是否可以通过LIM蛋白KyoT2来抑制急性T淋巴细胞白血病细胞中Notch信号的过度激活从而抑制急性T淋巴细胞白血病细胞的生长。我们在实验中构建了慢病毒载体Plenti/v5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,希望通过病毒包装感染细胞的方法来克服一般的转染方法对于悬浮细胞转染效率较低的困难,为进一步探究notch与急性T淋巴细胞白血病以及其他临床恶性血液肿瘤之间的关系奠定基础。Flt3L是一种膜蛋白,是酪氨酸激酶受体3(Flt3)的配体,与SCF、M-CSF有同源性,在人和鼠中有广泛的分布, Flt3L与Flt3受体结合后可向细胞传递促有丝分裂信号,调节细胞的生长、分化,促进多种干细胞、血细胞及其前体细胞的生成与分化。研究发现,Flt3L对树突状细胞(dendritic cells,DC)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lympho-cyte.CTL)等的增殖、分化和成熟也具有重要作用;并可与多种细胞因子协同,提高其刺激造血和免疫调节功能。树突状细胞(dendritic cells,DC)是一类重要的免疫呈递细胞,能够显著刺激初始T细胞的增殖,在免疫应答的启动、调控上起着关键作用,已有研究证实,小鼠皮下注射Flt3L后发现其淋巴和非淋巴组织中DC会明显增加,CDllc+ DC在脾脏淋巴结中的绝对数量也可以大量的增加,也有实验证实在小鼠气管内滴注Flt3L可以诱导局部大量成熟的DC细胞浸润来增强局部的免疫功能,但是这些研究有的是在体内进行的,有些是观察Flt3L对于造血前体细胞的作用,而Flt3L对于单核细胞诱导来源的DC是否有作用目前的研究还较少。试验中我们主要做了以下的工作:一构建Plenti/v5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体,并在Hela细胞中转染,进行了初步鉴定。二用人的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,在GM-CSF、IL-4条件下诱导分化为成熟的DC,并用流式测定Flt3L对单核细胞诱导来源的DC数量及对表面分子CD11c、CD83、HLA-DR表达的影响。结论:1构建了慢病毒载体Plenti/v5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,为进一步探究notch信号与急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)以及其他临床恶性血液肿瘤之间的关系,更好的寻找治疗新靶点奠定了一定的基础。2通过流式检测DC表面分子的表达,我们发现Flt3L对单核诱导来源DC细胞的数量没有产生明显的影响,但是可以增强其表面markerCD11c、CD83、HLA-DR的表达,促进DC的成熟,这可以为临床上用DC来做肿瘤的生物治疗提供一些参考。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
文献回顾  16-35
正文  35-51
  实验部分一  35-42
    1 材料和方法  35-37
    2 结果  37-40
    3 结论  40-41
    4 讨论  41-42
  实验部分二  42-51
    1 材料和方法  42-44
    2 结果  44-49
    3 结论  49-50
    4 讨论  50-51
小结  51-52
参考文献  52-61
个人简历和研究成果  61-62
致谢  62

KyoT2病毒载体的构建、Flt3L对单核诱导DC分化成熟的影响

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