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Pin1蛋白家族的结构研究

作　者: 孙丽芳
导　师: 刘益成；吴学记
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Pin1 圆二色谱 结晶 结构
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


蛋白质脯氨酸前的丝氨酸或苏氨酸的可逆磷酸化是一种重要的细胞信号调控机制。近来发现的肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1能特异地识别和结合蛋白质磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序,催化磷酸化的丝/苏-脯氨酸肽键发生顺反异构,从而改变磷酸化蛋白质的功能。越来越多的研究数据表明这种构型的改变影响了蛋白质的催化活性、去磷酸化水平、蛋白质与蛋白质之间的相互作用、蛋白质的亚细胞定位及蛋白的转运等。而且,这种磷酸化后的调节机制在细胞生长和疾病发生如癌症和阿尔茨海默氏病中起重要作用。但目前对于Pin1的这种催化调节机制、以及其与底物相互作用的研究还很少。本论文主要对人类Pin1蛋白及Pin1的两个关键结构域中的几个关键氨基酸Trp34、Lys63、Cys113、Met130进行定点突变,我们对这些蛋白进行了大量表达、分离、纯化,然后用悬吊液滴蒸汽扩散法制备得到晶体,通过回摆法收集衍射数据并进行晶体结构解析。目前我们得到了Human Pin1-WT、Pin1-W34A、Pin1-K63A、Pin1-C113A、Pin1-M130A。研究结果表明突变体Pin1-W34A对底物磷酸化特异性的识别能力及在体外的催化功能均丧失,而突变体Pin1-K63A、Pin1-C113A其底物磷酸化特异性识别功能不受影响,但它的催化功能丧失;同时,从Pin1-K63A、Pin1-C113A和Pin1-M130A中我们发现PPIase结构域可能存在两个磷酸根结合位点。同时我们成功克隆、表达了只含有PPIase结构域的拟南芥Pin1(AtPin1)、大肠杆菌Pin1(E.coli Par10)和布氏锥虫Pin1(TbPin1),并得到了AtPin1和E.coli Par10的晶体,但因AtPinl和E.coli Par10的晶体质量不高,还需再进行优化;而TbPin1目前还没有得到其晶体。该研究为进一步研究Pin1的作用机制奠定基础,并为以后基于Pin1的新药设计提供结构理论依据。

全文目录


摘要  10-11
Abstract  11-13
英文缩写目录  13-15
1 前言  15-34
  1.1 肽基脯氨酰顺反异构酶(PPlase)家族  15-16
  1.2 Pin1蛋白家族组成与分布  16-21
    1.2.1 Human Pin1蛋白  17-19
    1.2.2 Arabidopsis thaliana Pin1蛋白  19
    1.2.3 Trypanosoma brucei Pin1蛋白  19-20
    1.2.4 Escherichia coli Par10蛋白  20-21
  1.3 Pin1的功能调控  21
  1.4 Pin1与细胞周期调控  21-25
    1.4.1 Pin1与cyclinD  21-23
    1.4.2 Pin1与cdc25  23-24
    1.4.3 Pin1与P53  24-25
    1.4.4 Pin1与RNA聚合酶Ⅱ  25
  1.5 Pin1与各种疾病的关系  25-28
    1.5.1 Pin1与癌症  25-26
    1.5.2 Pin1与老年痴呆症(Alzheimer's disease,AD)  26-28
  1.6 蛋白质晶体学原理与结晶优化  28-31
    1.6.1 蛋白质的结晶原理和方法  28-29
    1.6.2 蛋白质的均一性对结晶的影响  29
    1.6.3 蛋白质结晶条件的筛选和优化  29-31
  1.7 蛋白质结构解析  31-32
  1.8 本课题的研究目的与意义  32-34
2 材料和方法  34-46
  2.1 材料  34-36
    2.1.1 细菌菌株及载体  34
    2.1.2 主要试剂  34
    2.1.3 主要仪器  34
    2.1.4 主要溶液的配制  34-36
  2.2 实验方法  36-46
    2.2.1 分子克隆和表达载体的构建  36-39
    2.2.2 E.Coli BL21(DE3)感受态的制备  39-40
    2.2.3 重组质粒转化E.coli BL21(DE3)  40
    2.2.4 重组质粒表达的小量检测  40
    2.2.5 高效表达条件的研究  40-41
    2.2.6 高效表达  41
    2.2.7 重组蛋白可溶性分析  41
    2.2.8 菌体的收集与破碎  41-42
    2.2.9 Pin1蛋白的分离纯化  42-43
    2.2.10 蛋白溶液的浓度测定—Bradford分析法  43
    2.2.11 Pin1蛋白的圆二色谱分析  43-44
    2.2.12 Pin1蛋白的结晶  44
    2.2.13 晶体数据的收集和处理——晶体结构解析  44-46
3 结果和分析  46-63
  3.1 分子克隆和表达载体的构建  46-47
  3.2 蛋白的表达及其分离纯化  47-53
    3.2.1 pET 28b/Human Pin1质粒的表达  47
    3.2.2 Pin1蛋白的分离纯化  47-53
    3.2.3 Pin1蛋白的浓缩及浓度的测定  53
  3.3 圆二色谱分析  53-56
  3.4 Pin1蛋白质的结晶和数据收集  56-58
  3.5 Pin1晶体结构解析  58-63
4 讨论  63-69
  4.1 突变位点的选择  63
  4.2 Pin1蛋白的结晶  63-65
    4.2.1 结晶方法的选择  63-64
    4.2.2 蛋白样品的处理  64
    4.2.3 晶体生长的条件  64-65
  4.3 Pin1催化反应机理  65-69
参考文献  69-76
致谢  76

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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