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Lewis y抗原对人卵巢癌细胞RMG-I-H部分耐药相关蛋白基因表达的影响

作　者: 刘晴
导　师: 林蓓
学　校: 中国医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 单克隆抗体基因转染培养皿细胞膜糖基化作用耐药机制细胞系基因表达上皮性卵巢癌高表达
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言卵巢癌的死亡率在女性生殖器肿瘤中最高,主要是由于缺乏有效的早期诊断方法以及化学药物治疗中肿瘤耐药性的产生。70%的卵巢癌患者在术后2年内复发,其发生的重要原因是卵巢癌细胞的耐药。因此,耐药的分子机制的研究对卵巢癌的临床疗效的改善及患者的生存率的提高意义重大。卵巢癌细胞耐药的产生涉及到多种机制,近来,细胞的聚糖及糖基化的变化与耐药之间的关系引起人们的关注。Lewis y抗原是细胞膜上的双岩藻糖基化寡聚糖,我们在前期研究中发现α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyltransferases,α1,2-FT）基因转染后的人卵巢癌细胞系RMG-I-H与转染前的细胞系RMG-I相比,出现了癌相关抗原Lewis y的高表达。进一步的实验证明,RMG-I-H在增殖,侵袭等恶性细胞生物学能力增加的同时,其对卵巢癌化疗中的常用药物卡铂、5-氟尿嘧啶及紫杉醇的耐药性也有所提高。因此,本次实验通过检测α1,2-FT基因转染前后的人卵巢癌细胞系RMG-I和RMG-I-H及Lewis y单克隆抗体处理前后细胞系RMG-I-H部分耐药相关蛋白基因:多药耐药基因-1（multidrug resistance 1,MDR-1）,多药耐药相关蛋白-1（multidrug resistance-associated protein-1,MRP-1）、多药耐药相关蛋白-2（multidrug resistance associated protein-2,MRP-2）、蛋白激酶C-α（protein kinaseC-α,PKC-α）及拓扑异构酶Ⅰ（topoismeraseⅠ,TopoⅠ）的表达差异,探讨Lewis y抗原与耐药相关蛋白基因的表达调节的相关性,为研究Lewis y抗原在人上皮性卵巢癌耐药机制中的作用奠定基础。材料和方法一、卵巢癌细胞株RMG-I为人卵巢透明细胞癌株,RMG-I-H为RMG-I稳定转染表达载体pcDNA3.1（-）-HFUT-H（含1,2-FT基因）获得的Lewis y高表达细胞系。二、RT-PCR取对数生长期RMG-I-H及RMG-I细胞,RNAout试剂常规提取细胞总RNA。各取4μg总RNA反转录合成cDNA,反应条件为70℃10 min,冰上冷却2 min以上,42℃60 min,70℃15 min。取逆转录产物行PCR扩增,反应条件为:94℃3 min后,以适当的循环数进行以下反应:94℃40 s;退火温度1 min;72℃1 min,最后为72℃7 min。PCR产物在3.0%琼脂糖凝胶中进行电泳后,经电泳凝胶成象分析仪拍照并分析处理。以各自内参照β-actin表达量为基准计算各条带的相对含量,进行基因表达水平的半定量分析。实验重复进行3次。三、免疫细胞化学方法取RMG-I-H及RMG-I细胞,各悬浮于含10%FBS的DMEM培养液中,接种到预先放置7 mm×22 mm盖玻片的培养皿（35 mm）中,置CO₂孵箱培养2 d,待细胞接近长成单层,取出盖玻片,浸入PBS洗2次,4%多聚甲醛固定,染色方法按SP试剂盒说明书进行。一抗兔抗人P-gp多克隆抗体1:100稀释。在40倍镜下观察,以细胞浆、细胞膜有棕黄色颗粒着色为阳性。实验重复三次。图像分析软件Meta Morph分析结果。四、裸鼠皮下移植瘤建立取RMG-I-H及RMG-I细胞制成单细胞悬液,记数活细胞数,调整细胞密度为1×10⁶/ml,选取10只4～6周龄健康雌性裸鼠,体重（20.4±0.6）g,随机分成两组,于背部皮下注射细胞悬液0.3 ml。裸鼠在SPF条件下饲养,定期观察小鼠精神、饮食及排便情况。五周后处死全部裸鼠,取出皮下瘤块,分离,制备成石腊块。五、免疫组化染色方法上述裸鼠皮下移植瘤经病理证实为低分化卵巢透明细胞癌。裸鼠皮下移植瘤石蜡块连续切片,厚度为4μm,脱蜡至水,PBS洗3次,每次3 min。胃蛋白酶室温孵育15 min修复,以下步骤同免疫细胞化学方法。六、Lewis y单克隆抗体阻断试验取指数生长期RMG-I-H细胞制成单细胞悬液,2×10⁵/培养皿接种于7个35 mm培养皿中,培养36 h后弃去培养液,收集1个培养皿中的细胞,提取RNA,以此时作为0时间点。同时另6个培养皿加入含2%胎牛血清的培养液,其中3个培养皿中加入抗Lewis y单克隆抗体,使其终浓度为10 ug/ml,作为实验组（抗体处理组）;不予处理的3个培养皿作为对照组（非处理组）。再继续培养6,9,24 h后,分别取实验组和对照组各一个培养皿,提取细胞RNA,进行RT-PCR,检测MDR-1、PKC-α、MRP-1、MRP-2及TopoⅠ的mRNA的表达。七、数据分析和统计应用SPSS11.5统计分析软件,检测数据以（?）±s表示,两组间比较进行t检验,多组间比较采用方差分析方法。P＜0.05视为有统计学意义。结果一、RMG-I-H与RMG-I中部分耐药相关蛋白基因的表达RT-PCR检测结果证明,RMG-I-H细胞中PKC-α、TopoⅠ、MRP-1及MRP-2的mRNA相对表达量分别为0.46±0.02、0.82±0.08、0.66±0.07和0.44±0.08,与其在RMG-I中的相对表达量0.27±0.05、0.52±0.04、0.34±0.12及0.23±0.05相比均明显增高（P均＜0.05）;而MDR-1在RMG-I-H细胞中（0.26±0.05）的相对表达量低于其在RMG-I中（0.45±0.08）的表达（P＜0.05）。二、RMG-I与RMG-I-H中P-gp的表达SP染色结果表明,在RMG-I-H细胞中P-gp染色阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色,广泛分布于细胞膜和细胞浆,其累积光密度为29.75±2.01;在RMG-I细胞中P-gp染色阳性颗粒呈淡黄色,弥散分布于细胞膜和细胞浆,累积光密度为17.05±0.56,RMG-I-H细胞的染色强度明显高于RMG-I（P=0.037）。三、RMG-I与RMG-I-H细胞裸鼠皮下移植瘤组织中P-gp的表达P-gp在裸鼠皮下移植瘤组织中染色状态如同细胞学,在RMG-I-H细胞移植瘤的组织中的染色较强,呈棕褐色或棕黄色,累积光密度为49.58±6.93;而在RMG-I细胞移植瘤的组织中染色呈淡棕黄色,累积光密度为20.09±4.09（P=0.023）。四、Lewis y抗体处理RMG-I-H前后部分耐药相关蛋白基因的表达水平的变化RMG-I-H细胞Lewis y糖基抗原被浓度为10 ug/ml的Lewis y单克隆抗体封闭后,MDR-1、MRP-1、MRP-2、PKC-α及TopoⅠmRNA的表达强度随处理时间的延长逐渐降低（P均＜0.05）,在24 h达到最低,而非处理组的变化则不明显（P均＞0.05）。另外,在6 h这一时间点抗体处理组的MDR-1、MRP-1 MRP-2、PKC-α及TopoⅠ的mRNA相对含量（0.36±0.05、0.18±0.02、0.15±0.04、0.40±0.09、0.42±0.03）均低于非处理组（0.70±0.07、0.80±0.04、0.51±0.08、0.74±0.13、0.77±0.13）,P均＜0.05,其抑制率分别为48.55%、77.50%、70.18%、45.86%和46.13%。结论本次实验结果表明人卵巢癌细胞表面高表达的Lewis y抗原与部分耐药相关蛋白基因表达的调节密切相关。

全文目录

一、摘要  4-13
  中文论著摘要  4-8
  英文论著摘要  8-13
二、英文缩略语  13-14
三、论文  14-25
  前言  14-15
  材料与方法  15-17
  结果  17-21
  讨论  21-24
  结论  24-25
四、本研究创新性的自我评价  25-26
五、参考文献  26-28
六、附录  28-38
  综述  28-36
  在学期间科研成绩  36-37
  致谢  37-38
  个人简介  38

Lewis y抗原对人卵巢癌细胞RMG-I-H部分耐药相关蛋白基因表达的影响

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