学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

血清传铁蛋白和乳传铁蛋白裂解焦磷酸键的酶学功能研究

作　者: 曾旭
导　师: 仲维清
学　校: 第二军医大学
专　业: 无机化学
关键词: 人血清脱金属铁传递蛋白牛奶乳铁蛋白焦磷酸根磷酸酯酶反应速率常数米氏常数核磁共振法紫外可见分光光度法
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 27次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

蛋白质的可逆磷酸化作用作为一种调节机制在生物体中发挥重要作用。在信号传导、基因转录、DNA复制、细胞分裂与分化等多种生理过程中,许多重要蛋白质和酶的生物活性都被磷酸基团的可逆加合即磷酸化和去磷酸化所调节。传铁蛋白是一大类遗传相关、生物功能相似、结构类似的非血红素铁结合蛋白。主要包括血清铁传运蛋白(serum transferrin, TF)、乳铁传运蛋白(lactotransferrin, LF)、卵传铁蛋白(ovotransferrin, OTF)。分子量约为70～80kDa,由单一肽链组成并构成两个功能相似的结构域,每个结构域分别以2个Tyr、1个Asp和1个His结合1个Fe3+,另有1个CO32-作为协同阴离子。它们的主要生理功能是负责运输铁和协助调节机体中铁的平衡。据文献报导,传铁蛋白家族中的某些乳传铁蛋白和铁结合蛋白(细菌中的传铁蛋白)具有磷酸(酯)酶的功能,因此,研究传铁蛋白磷酸(酯)酶学功能位点和作用机制并进一步确定它们在磷酸化过程的作用具有重要意义。本课题利用31P NMR及UV-Vis、ESI-MS、ICP-AES等技术,测定了人血清脱金属传铁蛋白(apo-hTF)及牛奶乳传铁蛋白与焦磷酸(PPi)及ATP反应的动力学参数,研究了该酶促反应的反应机制。在10mmol×L-1 pH 7.4 Hepes缓冲液中,312K温度下,PPi与apo-hTF反应时,5～10h后其31P NMR图谱上在约3.74ppm处出现对应于磷酸根的新信号峰,随着反应的进行,对应于PPi(-6.59ppm)峰的强度逐渐降低而对应于Pi的峰强度逐渐增大,说明apo-hTF具有催化裂解焦磷酸键的酶学功能。根据不同时间PPi的浓度和微分法原理,通过作图法发现该酶促反应为二级反应,当[PPi]: [apo-hTF] = 16:1、27:1、38:1、50:1时,表观反应速率常数分别为3.67×10-4、1.91×10-4、1.22×10-4、8.53×10-5L×mmol-1×h-(1pH 7.40,312K)。用初速率法测定速率常数为0.010382mmol×L-1×h-1(零级反应)。该酶促反应米氏常数Km为3.600,vm为0.00864mmol×L-1×h-1。在10mmol×L-1 pH 7.4 Hepes缓冲液中,298K时,向apo-hTF溶液中滴加PPi,在UV-Vis差谱上于245nm处产生一个负吸收峰,峰强度随着PPi浓度的增加而下降。这与PPi和Tyr直接反应的结果相似,说明PPi可通过氢键结合于apo-hTF中Fe3+的结合位点酪氨酸上(而His与PPi的结合却很弱)。当[PPi]:[apo-hTF]为2:1时结合达饱和,ICP-AES分析结果显示每蛋白分子可结合3.5个P,证实了该结果。因此,可以推测apo-hTF催化裂解焦磷酸键的反应分为两个步骤:PPi先通过氢键结合于蛋白中Fe3+的结合位点上,再发生催化水解反应。实验发现Ca2+对该酶促反应具有微弱的催化作用,表观反应速率常数为2.31×10-4L×mmol-1×h-1(pH 7.40,312K)。相同条件下,holo-hTF对PPi几乎没有作用,可能是因为holo-hTF中Fe3+的结合位点酪氨酸被封闭,PPi不能结合于该活性中心的缘故。Apo-hTF对ATP也没有作用,也可能是由于ATP分子较大,不能进入到apo-hTF中的活性中心的缘故。与holo-hTF不同,乳铁蛋白(LF)具有催化裂解焦磷酸键的酶学功能,反应也遵循二级动力学特征,当[PPi]:[LF] = 20:1、40:1、60:1、80:1、100:1时,测得表观反应速率常数分别为:3.45×10-4、2.42×10-4、1.36×10-4、3.30×10-5、2.50×10-6L·mmol-1·h-1(pH 7.40,312K)。用初速率法测定反应速率常数为0.00253mmol×L-1×h-1(零级反应)。该酶促反应的米氏常数Km为3.539,vm为0.026247mmol·L-1·h-1。实验发现apo-hTF、LF都有催化裂解PPi的磷酸(酯)酶功能,PPi首先通过氢键结合于铁的结合位点Tyr再进一步被催化水解,这为进一步研究转铁蛋白家族在磷酸化过程中的作用提供了初步的实验依据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
第一章前言  11-17
  一、蛋白质可逆磷酸化及蛋白质磷酸化酶  11
  二、传铁蛋白及其功能  11-16
  三、本文研究的意义及思路  16-17
第二章人血清脱金属传铁蛋白裂解焦磷酸键的研究  17-34
  一、仪器与试剂  18
  二、实验方法  18-23
  三、结果与讨论  23-34
第三章人血清脱金属铁传递蛋白裂解ATP的研究  34-38
  一、仪器与试剂  34-35
  二、实验方法  35-36
  三、结果与讨论  36-38
第四章牛奶乳传铁蛋白裂解焦磷酸键的研究  38-48
  一、仪器与试剂  39
  二、实验方法  39-42
  三、结果与讨论  42-48
全文总结  48-50
进一步研究设想  50-51
附录  51-54
参考文献  54-57
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明  57-58
致谢  58

血清传铁蛋白和乳传铁蛋白裂解焦磷酸键的酶学功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文