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桑黄、蛴螬药用活性成份的分离纯化与功能研究

作　者: 孙捷
导　师: 高国富；张克云
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物学
关键词: 桑黄凝集素多糖白星花金龟
分类号: R282.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

“桑黄”为担子菌亚门（Basidiomycotina）,层菌纲（Hymenomycetes）,多孔菌目（Polyporales）,锈革孔菌科（Hymenochaetacae）,针层孔菌属（Phellinus）的真菌,,东亚的国家中已经被当作一种传统的药使用,用于治疗胃肠混乱,降火和淋巴的疾病。特别是它的抗肿瘤活性,桑黄也有许多优势作为抗癌候选药之一,被人们所关注。本文的第一部分研究内容为从桑黄发酵液中分离活性成份,寻找具凝集活性、抗菌活性的有机分子,为开发新的天然药物作准备。本实验通过冷冻干燥、离子交换和HPLC层析等方法,从药用真菌桑黄的发酵液中分离纯化了一种凝集素,SDS-PAGE检测其为单一蛋白条带,分子量约24kDa,与HPLC分析分子量一致,证明该凝集素为单亚基蛋白。SHL可以凝集供试的小鼠血红细胞和4种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明,SHL不被D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖所抑制。SHL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺等二价阳离子的影响。用相似的处理方法,我们从桑黄发酵液中分离到一种相对分子质量为20kD的抗真菌生物活性物质。桑黄已经被知道具有各种不同的生物学的活性.但是从鲍氏针层孔菌（Phellinus baumii）提取多糖却极少被报道.本实验中水溶性多糖由热水抽出与菌丝分开,游离蛋白质用Sevage法移除。多糖由阴离子交换和凝胶层析纯化。由DEAE-Sephadex-50阴离子交换层析时用0-1.1M NaCl洗脱.再用纯化后,再用sephadex G-75测定其分子量为17,000D.再测定其各项生物活性,该多糖被发现显着地增加巨噬细胞的增殖.同时,可以明显抑制HepG2细胞和HCT细胞的增殖.本文的第二部分研究内容为白星花金龟幼虫中多糖的提取与纯化。用相似的处理方法,以我国药用昆虫白星花金龟（Protaetia brevitarsis）幼虫（蛴螬）为研究对象,通过匀浆,乙醇沉淀,Sevag法去除蛋白,得到蛴螬总多糖。经MTT法检测,证明其对小鼠脾细胞及巨噬细胞有明显的促增殖作用。对总多糖用苯酚硫酸法进行浓度测定,并用离子柱DEAE-Sephadex A-25,LPLC-Sephadex G-75分离纯化得到两种可以促进脾细胞增殖的,分子量分别为42kDa和26kDa的蛴螬多糖。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-32
  1.桑黄及其药理作用研究进展  10-16
    1.1.药用真菌"桑黄"的分类及生物学特征  10-12
    1.2.药用真菌的生长特性  12-13
    1.3 桑黄的药理作用  13-15
    1.4 前景与展望  15-16
  2.多糖类药物的研究进展  16-22
    2.1 多糖背景  16-17
    2.2 多糖的提取分离、分离、纯化  17-19
    2.3 多糖的药理作用  19-22
    2.4 多糖的发展前景  22
  3.凝集素的研究历史及进展  22-28
    3.1 凝集素的糖与血型特异性  22-23
    3.2 凝集素对淋巴细胞的促有丝分裂作用和对癌细胞凝集  23
    3.3 大量凝集素的发现  23-24
    3.4 从凝集素的一级结构到三级结构  24-25
    3.5 凝集素的糖识别域  25
    3.6 凝集素的保护和共生作用  25-26
    3.7 凝集素作为识别分子  26-28
  4.蛴螬及其药理作用研究进展  28
  参考文献  28-32
第二章桑黄发酵液凝集素的分离纯化和功能研究  32-39
  1 材料与方法  32-34
    1.1 材料  32
    1.2 方法  32-34
  2 结果  34-37
    2.1 发酵时间对凝集活性的影响  34
    2.2 凝集素的纯化和检测  34
    2.3 采用SDS-PAGE垂直板型凝胶电泳测定分子量  34-37
    2.4 糖抑制实验  37
    2.5 金属离子及EDTA对凝血活性的影响  37
    2.6 pH对血凝活力的影响  37
    2.7 温度对血凝活力的影响  37
    2.8 Sephadex G-75凝胶层析测定分子量  37
    2.9 对各种血细胞的凝集效果  37
  3 讨论:  37-38
  参考文献  38-39
第三章桑黄发酵液抗真菌活性研究  39-45
  1 材料与方法  39-40
    1.1 材料和试剂  39
    1.2 方法  39-40
  2 结果  40-44
    2.1 抗菌活性检测  40-41
    2.2 抗菌活性成分分离纯化  41
    2.3 用Sephadex G-75测定分子量  41-44
  3 讨论  44
  参考文献  44-45
第四章桑黄多糖的分离纯化与功能研究  45-54
  1.材料和方法  45-46
    1.1 材料和试剂  45
    1.2 方法  45-46
  2.结果  46-51
    2.1 MTT法测粗多糖对脾细胞增殖的实验结果  46-47
    2.2 MTT法测粗多糖对巨噬细胞增殖的实验结果,  47
    2.3 MTT法测粗多糖对抑制肿瘤细胞增殖的实验结果,  47-48
    2.4 多糖的分离纯化  48-50
    2.5 以葡萄糖作标准曲线实验结果  50-51
    2.6 用Sephadex G-75测定分子量  51
  3.讨论  51
  参考文献  51-54
第五章蛴螬多糖对小鼠免疫细胞体外增殖的研究  54-64
  1.材料和方法  54-56
    1.1 材料  54
    1.2 方法  54-56
  2.结果  56-61
    2.1 以葡萄糖作标准曲线测定浓度  56
    2.2 粗多糖对脾细胞增殖作用  56
    2.3 MTT法测粗多糖对巨噬细胞增殖作用  56
    2.4 多糖的分离纯化  56-57
    2.5 用Sephadex G-75测定分子量  57-61
  3.讨论  61-62
  参考文献  62-64
创新之处  64-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表的学术论文目录  66

桑黄、蛴螬药用活性成份的分离纯化与功能研究

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