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猪戊型肝炎病毒抗体ELISA检测方法的建立及其上海地区HEV分子流行情况的调查

作　者: 牟静
导　师: 侯加法；华修国
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪戊型肝炎 ORF2 ELISA RT-nPCR 流行病学
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）,是由戊型肝炎病毒毒（Hepatitis E Virus,HEV）引起的一种人和多种动物的人兽共患病。一般在亚洲和非洲一些卫生条件较差的发展中国家暴发流行,发达国家则呈散发,我国是主要流行国家。HEV的可以感染多种动物,其中猪是非常重要的宿主,在跨种间感染与传播中起着重要作用。本研究以上海地区猪戊型肝炎主要流行株为标本,以RT-nPCR扩增ORF2基因目的片段,并将其插入到pMD-18 T 5imple载体中,构建克隆载体pMD-ORF2。克隆的基因片段长666 bp,编码222个氨基酸。与部分不同基因型代表株氨基酸序列比对分析发现,与基因型4的同源性最高,亲水性和抗原性较好。对克隆载体pMD-ORF2进行双酶切,将得到的666bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-30a（+）中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL₂₁中,在37℃IPTG诱导1.0 h下该片段获得良好表达。经SDS-PAGE鉴定,其表达的融合蛋白约为33 kD,与预期值相符。经Ni-亲和层析柱纯化后,得到单一的目的蛋白条带。免疫转印试验显示,该重组蛋白可被猪或人HE阳性血清识别,表明该重组蛋白具备HEV天然毒株抗性,且与人HEV存在抗体交叉反应性.重组蛋白尿素洗涤上清作SDS-PAGE和Westernblot,均显示表达的蛋白有良好抗原性。以LHEV中国猪源株ORF2（394-617 aa）基因工程表达蛋白作为包被杭原,猪HEV阳性血清作为第一抗体,以HRP标记的PSA（HRP-SPA）代替酶标抗体作间接ELISA来检测猪血清中的HEV lgG。方阵滴定试验确定,蛋白的最佳包被浓度约为2μg/孔,猪血清的最佳稀释度为1:100,HRP-SPA代替酶标二抗其工作浓度为1:10000,从而建立了间接ELISA方法。随机选取87份猪血清,分别用所建立试剂盒和HEV总抗体检测试剂盒（北京万泰抗原夹心法）两种方法检测HEV,结果表明所建立试剂盒检出IgG 70份阳性（阳性率为80.4%）,万泰试剂盒检出64份IgM及IgG阳性（阳性率为73.5%）,两种方法的符合率为91.4%（70/64）。用所建立试剂盒检测采自上海周边地区猪场的553份猪血清样本中的HEV IgG抗体,调查上海地区HEV的感染状况。结果表明,总阳性率64.56%（357/553）。采取上海猪场61份猪粪,进行RT-PCR检测,检测到10份阳性,测序发现10个克隆均为4型,说明上海主要流行株是基因4型。

全文目录

中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词  11-13
第一章猪戊型肝炎病毒的研究进展  13-35
  1 目前对猪戊型肝炎的研究进展  14-32
    1.1 猪戊型肝炎病毒研究进展  14-25
    1.2 临床症状和病理变化  25
    1.3 实验室检测方法及免疫反应  25-30
    1.4 预防及HEV疫苗的研究  30-32
  2 目前存在的问题  32-33
  3 研究的目的和意义  33-35
第二章 ORF2片段的克隆及其序列分析  35-47
  1 材料  35-36
    1.1 毒株  35
    1.2 菌株、质粒和血清  35
    1.3 主要试剂  35-36
    1.4 主要仪器  36
    1.5 引物设计  36
  2 方法  36-42
    2.1 用具处理  36-37
    2.2 粪便样品的处理  37
    2.3 病毒RNA的提取  37
    2.4 目的基因的扩增和克隆  37-40
    2.5 PCR产物的T/A连接  40
    2.6 连接产物的转化  40-41
    2.7 重组质粒pMD-ORF2的酶切鉴定和PCR鉴定  41-42
  3 结果  42-44
    3.1 所选片段抗原性及亲水性分析  42
    3.2 目的基因的扩增  42-43
    3.3 序列测定结果  43-44
  4 讨论  44-47
第三章抗原蛋白的表达及其间接ELISA的建立  47-66
  1 材料  48
    1.1 主要试剂  48
    1.2 主要仪器  48
    1.3 引物  48
  2 方法  48-56
    2.1 RT-PCR扩增目的片段  48-49
    2.2 目的片段的回收纯化  49
    2.3 目的片段和表达载体质粒的酶切  49-50
    2.4 重组质粒的筛选及鉴定  50-52
    2.5 诱导表达并鉴定  52-53
    2.6 Western-blot检测重组蛋白的抗原性  53
    2.7 重组蛋白的纯化及检测  53-54
    2.8 用纯化的抗原免疫兔子  54-55
    2.9 间接法抗HEV-IgG EUSA  55-56
  3 结果  56-63
    3.1 目的片段的酶切鉴定  56-57
    3.2 不同时相融和蛋白的表达  57
    3.3 用MagExtractor-His-tag-kit纯化蛋白结果  57-58
    3.4 Western blot鉴定结果  58-59
    3.5 融合蛋白间接ELISA方法的建立  59-63
      3.5.1 最佳蛋白包被浓度和血清稀释度的确定  59-60
      3.5.2 最佳HRP标记的羊抗猪IgG的稀释度的确定  60
      3.5.3 抗原抗体最佳反应时间的确定  60
      3.5.4 HRP标记的羊抗猪IgG最佳反应时间的确定  60-61
      3.5.5 重复性试验  61-62
      3.5.6 间接ELISA结果及临界值判定  62
      3.5.7 特异性实验结果  62
      3.5.8 底物作用时间的确定  62
      3.5.9 商品化试剂盒检测结果  62-63
  4 讨论  63-64
  5 小结  64-66
第四章上海猪场戊型肝炎病毒抗体和抗原在动物体中的检测  66-75
  1 材料  67
    1.1 主要试剂和仪器  67
    1.2 血清和粪便样品来源  67
  2 方法  67-69
    2.1 戊肝病毒抗体的检测  67
    2.2 戊肝病毒RNA的检测  67-69
      2.2.1 引物设计  67-68
      2.2.2 RNA提取  68
      2.2.3 目的基因的扩增和克隆  68-69
      2.2.4 PCR产物鉴定  69
      2.2.5 PCR鉴定  69
      2.2.6 测序及序列分析  69
  3 结果  69-73
    3.1 血清中抗-HEV抗体  69-71
    3.2 HEV RNA的检测  71-72
    3.3 测序结果分析  72
    3.4 系统遗传进化分析  72-73
  4 讨论  73-75
全文总结  75-76
参考文献  76-90
致谢  90-91
在读研期间已发表文章  91

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