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共表达霸王ZxNHX及ZxVP1-1基因提高百脉根的耐盐性和抗旱性研究

作　者: 王燕雯
导　师: 王锁民
学　校: 兰州大学
专　业: 草业科学
关键词: 共转化百脉根 ZxNHX ZxVP1-1 耐盐性抗旱性
分类号: S541.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

干旱和高盐是影响农作物产量及生态环境可持续发展的主要因素。多年生优良豆科牧草百脉根,在我国西北地区的农牧业发展及生态环境建设中发挥着重要作用。但大多数百脉根品种耐盐抗旱能力较弱,很难适应高盐及干旱的生长环境。因此,对其进行遗传改良,培育具有较强耐盐抗旱性的新品系,对西北地区农牧业的可持续发展、生态环境的恢复重建以及盐碱地和荒漠化土地的改良利用具有重要的现实意义。研究表明,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)和H+-焦磷酸酶(H+-PPase)在植物离子区域化中发挥着重要作用,超表达NHX或H+-PPase均可提高转基因植物的耐盐性和抗旱性。本实验室在前期的工作中发现,多年生长在干旱覆沙地上的强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)具有极强的Na+区域化能力,从而提高其耐盐性和抗旱性。因此,本文以百脉根品种迈瑞博为实验材料,通过根癌农杆菌介导法成功将携带霸王离子区域化基因ZxNHX和ZxVP1-1的双价载体转入百脉根,采用PCR及RT-PCR检测得到15株共转化百脉根植株,并对转基因植株的耐盐性和抗旱性进行检测,主要结果如下：1.用旱生植物霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX和H+-PPase基因ZxVP1-1对百脉根进行遗传转化,获得了15株阳性植株；PCR分析表明ZxNHX和ZxVP1-1基因均已整合进这些阳性植株的基因组中；对所有阳性系列进行RT-PCR分析,发现ZxNHX和ZxVP1-1基因在所有系列中都正确表达,但其表达量在不同系列间存在差异,且这种差异在2个基因间具有协同性,如ZxNHX和ZxVP1-1均在系列1中表达量最高,系列15中表达量最低。2.对转基因百脉根进行耐盐性和抗旱性检测分析,发现转基因百脉根生长更快,且耐盐抗旱性显著增强。在高盐和水分胁迫下,野生型百脉根发生萎蔫,生长受到严重抑制,生物量下降,甚至死亡；而转基因百脉根株系仍然存活并保持正常生长,表现出更强的耐盐抗旱性。随着NaCl浓度的增加及干旱胁迫时间的延长,所有植株的生长均受到抑制,但野生型植株受到的抑制更为明显。3.阳离子含量的测定结果表明：不论在正常生长条件,还是在盐或干旱胁迫下,转基因百脉根比野生型植株在叶和根中积累了更多的Na+、K+和Ca2+；这可能是ZxNHX和ZxVP1-1基因的超表达增强了转基因株系的Na+区域化能力,使其在盐及干旱条件下积累了更多的细胞溶质,降低转基因百脉根在胁迫条件下的细胞渗透势,维持了细胞膨压：与野生植株相比,在盐胁迫和干旱胁迫下,转基因百脉根具有更低的叶片渗透势,保持了较多的水分；同时,Na+区域化能力的增强可减轻过量Na+对细胞所造成的毒害作用：ZxNHX和ZxVP1-1基因的超表达使得转基因百脉根株系的细胞膜受损程度显著低于野生型株系,而光合能力却显著高于野生型株系。以上结果说明ZxNHX和ZxVP1-1的超表达促进了转基因百脉根细胞的Na+区域化能力,同时增强了其细胞对其它阳离子的吸收能力。这一方面可以减少盐胁迫下细胞质中过量Na+对各类细胞器和细胞膜的伤害作用,并稳定细胞内的离子平衡；另一方面可将Na+作为一种有益的渗透调节剂来提高细胞的渗透调节能力,使转基因百脉根能在盐或干旱胁迫下保持较多水分并维持细胞膨压,进而提高转基因植株的耐盐抗旱性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-9
第一章引言  9-11
第二章国内外研究进展  11-25
  2.1 植物液泡膜NHX研究进展  11-13
    2.1.1 液泡膜NHX发现及分子克隆  11-12
    2.1.2 液泡膜NHX的主要功能  12
    2.1.3 过量表达液泡膜NHX编码基因增强植物的耐盐性  12-13
  2.2. 液泡膜H~+-PPase的研究进展  13-19
    2.2.1 液泡膜H~+-PPase的分布与类型  13-14
    2.2.2 液泡膜H~+-PPase蛋白的特性和拓扑结构  14-16
    2.2.3 液泡膜H~+-PPase的主要功能  16-18
    2.2.4 液泡膜H~+-PPase的过量表达增强植物的耐盐性与抗旱性  18-19
  2.3 百脉根遗传转化研究进展  19-23
    2.3.1 农杆菌介导百脉根遗传转化的原理  20
    2.3.2 百脉根遗传转化研究进展  20-23
  2.4 结语  23-25
第三章根癌农杆菌介导双元载体ZxVP1-1-NHX对百脉根的遗传转化  25-35
  3.1 材料与方法  25-29
    3.1.1 实验材料  25-26
    3.1.2 农杆菌介导的遗传转化  26-27
    3.1.3 转基因植株的分子检测  27-29
  3.2 结果分析  29-33
    3.2.1 选择培养基中HPT选择压的确定  29-30
    3.2.2 转基因植株的获得  30-31
    3.2.3 植物基因组DNA的完整性检测  31
    3.2.4 转基因植株的PCR检测  31
    3.2.5 目的基因在转基因百脉根中表达的RT-PCR分析  31-33
  3.3 讨论  33-35
第四章转基因植株的抗逆性检测  35-47
  4.1 材料与方法  35-37
    4.1.1 植物材料  35
    4.1.2 实验方法  35-36
    4.1.3 相关指标的测定  36-37
    4.1.4 数据分析  37
  4.2 结果与分析  37-44
    4.2.1 ZxNHX-ZxVP共转化百脉根株系具有更强的耐盐性  37-38
    4.2.2 ZxNHX-ZxVP共转化百脉根株系具有更强的抗旱性  38-39
    4.2.3 转基因百脉根株系中积累了更多的阳离子  39-42
    4.2.4 ZxVP和ZxNHX基因的超表达降低了转基因百脉根的叶片渗透势  42
    4.2.5 转基因百脉根株系具有较高的叶片相对含水量  42-43
    4.2.6 转基因百脉根株系的细胞膜受损程度低于野生型植株  43
    4.2.7 转基因百脉根的净光合速率显著高于野生型植株  43-44
  4.3. 讨论  44-47
第五章结论  47-48
参考文献  48-57
在学期间的研究成果  57-58
项目资助  58-59
致谢  59

共表达霸王ZxNHX及ZxVP1-1基因提高百脉根的耐盐性和抗旱性研究

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