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海南省菠萝主要病原真菌鉴定及病原病毒多重RT-PCR检测体系的建立

作　者: 罗志文
导　师: 何凡
学　校: 海南大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 菠萝 真菌病原鉴定 病毒病原鉴定 生物学特性研究 rDNA-ITS扩增 RT-PCR检测 多重RT-PCR体系
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 35次
引　用: 1次
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内容摘要


菠萝Ananas comosus (L.) Merr.,属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)多年生单子叶常绿草本果树植物,在我国主要分布于广东、海南、广西、台湾、福建、云南等省(区),在海南菠萝更是著名的三大热带水果之一。在众多影响菠萝产业健康发展的因素中,病害因子一直以来都是影响海南菠萝生长生产的最重要因素,但由于缺乏系统性的调查研究,目前各界对海南省菠萝病害的了解还不甚深入和全面。本研究针对该问题,对海南省菠萝主产区真菌及病毒病害进行了较为系统、细致的调查研究,取得以下主要结果：1.调查显示海南省菠萝主要病害有9种,其中以凋萎病(Pineapple Mealybug Wilt,PMW)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、烂果病(Alternaria alternata (Fr.)Keissler)及心腐病(Phytophthora parasitica Dast.)的危害最为普遍和严重,而灰斑病(Exserohilum rostratum (Drech) Leo.&Sug.)和轮斑病(Chaetomium aureum Chivers)为食用菠萝上首次发现、报道。2.病原菌生物学特性研究表明：炭疽病病原菌(C. gloeosporioides)菌丝生长及孢子萌发最适温度分别为28℃和28～30℃；病原菌生长和孢子萌发最适pH值为7和6；麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖均为病原孢子萌发的适宜碳源；病原在含酵母浸粉的Czapek培养基上生长最好,酵母浸粉、天冬氨酸、牛肉浸膏和蛋白胨有利于孢子萌发；完全黑暗最利于菌丝生长,分生孢子在完全光照和光/暗交替条件下的萌发率较高；病原孢子水滴条件下的孢子萌发率最高；病菌致死温度为55℃处理10min。烂果病病原菌(A. alternata)菌丝生长和孢子萌发最适生长温度分别均为28℃；菌丝生长和孢子萌发最适pH值为9和8；麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,蔗糖、半乳糖、果糖和木糖为病原分生孢子萌发的适宜碳源；病原生长的最适宜氮源为硝酸铵,酵母浸粉和天冬氨酸有利于孢子萌发；完全光照最利于菌丝生长,分生孢子在光/暗交替条件下萌发率最高；病原孢子在RH≥95%的条件下才能萌发,水滴条件下孢子萌发率最高；病菌致死温度为55℃处理20min。灰斑病病原菌(E. rostratum)最适生长和萌发最适温度分别为28℃和30℃；病原生长和萌发最适pH分别为8和7～8；半乳糖、蔗糖和麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,木糖、蔗糖和麦芽糖较有利于孢子萌发；病原在含酵母浸粉、蛋白胨和硝酸铵的Czapek培养基上生长最好,酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨有利于孢子萌发；光暗交替最利于菌丝生长和孢子萌发；RH≥90%时,病原孢子开始萌发,水滴条件下病原孢子的萌发率最高(72.50-96.33%)；病菌致死温度为55℃处理15min。3.部分病原rDNA-ITS序列分析结果表明：2株烂果病病原菌和2株灰斑病病原菌的ITS序列分别为569bp和602bp,经比对与同源性分析,获得的序列确为交链链格孢菌(A. alternata)和喙状凸脐孢菌(E. rostratum)的ITS序列,与形态学鉴定的结果相符,利用真菌rDNA-ITS序列分析对不能通过形态学特征直接鉴定出来的病原菌进行辅助鉴定、分类是可行、有用和可靠的。4.凋萎病疑似病株病原RT-PCR检测结果表明：所扩增到的4个目的片段大小分别为520、542、473和730bp,同源性比对后发现此4个片段分别属PMWaV-1 HSP70h、PMWaV-2 HSP70h、PMWaV-3 HSP70h和PBCoV Polyprotein基因的部分序列,故初步确认海南省菠萝凋萎病疑似样本中至少存在PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3和PBCoV共4种病毒的复合侵染。5.病毒病原多重RT-PCR检测试验结果表明：海南省菠萝三种病毒PMWaV-1、PMWaV-2及PBCoV多重RT-PCR体系的最优因子分别为(25μL体系)：退火温度(Tm)53℃, dNTPs浓度100-200μM, Taq酶浓度0.5-1.0U,延伸时间60-90s,循环次数30～35次,此条件下可以同时、快速、有效地检测到凋萎病植株中的三种病毒。灵敏度试验结果显示,本体系对PMWaV-2的检测灵敏度最高,PBCoV其次,PMWaV-1最低,换算结果表明能从最少相当于10-2、10-5和10-3μg的样品中分别检测到PMWaV-1 PMWaV-2和PBCoV三种病毒,而若要同时检测到这三种病毒,则最少需要相当于10-2μg的样品量或组织量。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-13
1 前言  13-25
  1.1 菠萝的生物学特性  13
  1.2 菠萝的价值  13-15
    1.2.1 营养价值  13-14
    1.2.2 医用价值  14
    1.2.3 其他价值  14-15
  1.3 菠萝产业现状及影响因素  15-17
    1.3.1 发展现状  15-16
    1.3.2 影响我国菠萝产业发展的因素  16-17
  1.4 菠萝真菌病害研究进展  17-19
    1.4.1 叶斑病  17
    1.4.2 心腐病  17-18
    1.4.3 果腐病  18
    1.4.4 生物学特性研究在真菌鉴定中的应用  18
    1.4.5 分子生物学在真菌鉴定中的应用  18-19
      1.4.5.1 发展简史与现状  18-19
      1.4.5.2 rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用  19
  1.5 菠萝病毒病及其病原检测技术研究进展  19-24
    1.5.1 凋萎病  19-21
    1.5.2 杆状病毒病  21
    1.5.3 黄点病  21-22
    1.5.4 褪绿条纹病  22
    1.5.5 菠萝病毒检测技术  22-24
      1.5.5.1 电镜检测(EM)与免疫电镜检测(ISEM)  22-23
      1.5.5.2 间接酶联免疫吸附(ELISA)检测  23
      1.5.5.3 组织印迹免疫法(TBIA)  23
      1.5.5.4 核酸分析检测  23
      1.5.5.5 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测  23-24
    1.5.6 多重RT-PCR技术及其在植物病毒检测中的应用  24
  1.6 本研究的目的与意义  24-25
2 材料与方法  25-37
  2.1 试验材料  25-26
    2.1.1 供试植物样本材料  25
    2.1.2 供试菌株  25
      2.1.2.1 生物学特性研究供试菌株  25
      2.1.2.2 分子生物学实验供试菌株及病毒材料  25
    2.1.3 供试培养基  25-26
    2.1.4 供试试剂及试剂盒等材料  26
    2.1.5 主要溶液配制方法  26
  2.2 试验方法  26-37
    2.2.1 病害调查与病原鉴定  26-27
      2.2.1.1 病害种类的确定  26-27
      2.2.1.2 病情调查  27
      2.2.1.3 病害样本采集  27
    2.2.2 真菌病原的分离、纯化与形态学鉴定  27-29
      2.2.2.1 真菌病原的分离  27
      2.2.2.2 真菌病原的纯化  27-28
      2.2.2.3 真菌病原的致病性测定  28
      2.2.2.4 真菌病原的保存与形态学鉴定  28-29
    2.2.3 真菌病原的生物学特性研究  29-30
      2.2.3.1 温度对菌丝生长及分生孢子萌发的影响  29
      2.2.3.2 pH对菌丝生长及分生孢子萌发的影响  29
      2.2.3.3 碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响  29
      2.2.3.4 氮源对菌丝生长和孢子萌发的影响  29-30
      2.2.3.5 光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响  30
      2.2.3.6 湿度对孢子萌发的影响  30
      2.2.3.7 致死温度和时间的测定  30
      2.2.3.8 数据处理  30
    2.2.4 真菌病原的分子鉴定  30-32
      2.2.4.1 菌体材料的获取  30
      2.2.4.2 病原菌基因组DNA的提取  30
      2.2.4.3 病原菌基因组rDNA-ITS序列扩增  30-31
      2.2.4.4 PCR产物回收  31
      2.2.4.5 连接  31
      2.2.4.6 转化  31
      2.2.4.7 抗生素筛选阳性克隆  31-32
      2.2.4.8 菌液PCR鉴定  32
      2.2.4.9 测序与分析  32
    2.2.5 病毒病原的分子检测  32-37
      2.2.5.1 样本采集与保存  32
      2.2.5.2 样本总RNA的提取  32-33
      2.2.5.3 1st-strand cDNA的合成  33
      2.2.5.4 引物准备  33-34
      2.2.5.5 反应体系及程序设置  34-36
        2.2.5.5.1 病毒RT-PCR检测反应体系及程序设置  34
        2.2.5.5.2 病毒多重RT-PCR检测反应体系及程序设置  34-36
          2.2.5.5.2.1 引物特异性检测  35
          2.2.5.5.2.2 单重PCR反应退火温度试验  35
          2.2.5.5.2.3 多重PCR反应体系与程序设置  35-36
      2.2.5.6 连接、转化、测序与分析  36-37
3 结果与分析  37-68
  3.1 病害调查与真菌病原形态学鉴定结果  37-46
    3.1.1 炭疽病  37-38
    3.1.2 链格孢烂果病  38-40
    3.1.3 心腐病  40
    3.1.4 弯孢霉黑斑病  40-41
    3.1.5 刺环裂壳孢叶斑病  41-43
    3.1.6 拟盘多毛孢红斑病  43-44
    3.1.7 凸脐蠕孢灰斑病  44-45
    3.1.8 毛壳菌轮斑病  45-46
  3.2 真菌病原生物学特性研究  46-55
    3.2.1 菠萝炭疽病病原菌生物学特性研究  46-49
      3.2.1.1 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响  46-47
      3.2.1.2 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响  47
      3.2.1.3 碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响  47
      3.2.1.4 氮源源对菌丝生长和孢子萌发的影响  47
      3.2.1.5 光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响  47-48
      3.2.1.6 湿度对孢子萌发的影响  48
      3.2.1.7 致死温度和时间的测定  48-49
    3.2.2 菠萝烂果病病原菌生物学特性研究  49-52
      3.2.2.1 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响  49
      3.2.2.2 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响  49-50
      3.2.2.3 碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响  50
      3.2.2.4 氮源源对菌丝生长和孢子萌发的影响  50-51
      3.2.2.5 光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响  51
      3.2.2.6 湿度对孢子萌发的影响  51
      3.2.2.7 致死温度和时间的测定  51-52
    3.2.3 菠萝灰斑病病原菌生物学特性研究  52-55
      3.2.3.1 温度对菌丝生长和孢子萌发的影响  52-53
      3.2.3.2 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响  53
      3.2.3.3 碳源对菌丝生长和孢子萌发的影响  53-54
      3.2.3.4 氮源源对菌丝生长和孢子萌发的影响  54
      3.2.3.5 光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响  54
      3.2.3.6 湿度对孢子萌发的影响  54
      3.2.3.7 致死温度和时间的测定  54-55
  3.3 分子生物学方法鉴定真菌病原  55-57
    3.3.1 病原菌基因组DNA的提取  55
    3.3.2 病原菌基因组rDNA-ITS序列扩增  55
    3.3.3 菌液PCR检测结果  55-56
    3.3.4 目的片段测序结果分析  56-57
  3.4 病毒病害的分子检测  57-62
    3.4.1 样本总RNA的提取  57-58
    3.4.2 RT-CR检测病毒种类  58-59
    3.4.3 目的片段测序结果分析  59-62
  3.5 病毒的多重RT-PCR检测  62-68
    3.5.1 多重RT-PCR引物特异性检测与目的序列分析  62-64
    3.5.2 单重RT-PCR反应退火温度梯度试验结果分析  64-65
    3.5.3 多重RT-PCR体系反应因子梯度试验结果分析  65-67
      3.5.3.1 退火温度梯度试验结果分析  65
      3.5.3.2 dNTPs梯度试验结果分析  65-66
      3.5.3.3 Taq酶梯度试验结果分析  66
      3.5.3.4 延伸时间梯度试验结果分析  66
      3.5.3.5 PCR循环次数梯度试验结果分析  66-67
    3.5.4 多重RT-PCR体系灵敏度试验结果分析  67-68
4 结论与讨论  68-72
参考文献  72-80
致谢  80-81
附录A  81-82
附录B  82-84
附录C  84-87

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 多年生草本果类病虫害
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