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RSKA/hIGF-Ⅰ真核表达质粒延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

作　者: 郑水长
导　师: 高仕长
学　校: 重庆医科大学
专　业: 外科学
关键词: α-肌动蛋白胰岛素样生长因子1 生长激素基因重组转染聚乙烯亚胺失神经肌萎缩电生理坐骨神经
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-I,hIGF-1)的主要作用是调节细胞、组织的生长发育和再生,在骨骼肌中的作用是促进未成熟和受损伤的骨骼肌的成熟和再生。随着基因转染技术的发展,将外源性基因导入特定的靶细胞或组织中使之稳定高效表达,并发挥其作用已成为可能。本实验即是以真核表达质粒PBluescriptⅡSK ( + )为载体,构建携hIGF-1编码基因的真核表达质粒PBS-RSKA/hIGF-1,通过基因转染使其稳定表达,为治疗骨骼肌萎缩提供了一种新的方法和思路。目的:构建携带RSKA/hIGF-I杂交基因的重组真核表达质粒并在C2C12细胞内表达,为进一步研究骨骼肌萎缩的基因治疗提供依据。方法:登录Genbank数据库,查找大鼠骨骼肌α-肌动蛋白(RSKA)启动子序列、人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)cDNA序列和人生长激素(hGH)3′尾端非编码区序列(3′UTR),把三段基因序列拼接后进行全基因合成,再将合成的全基因融合到PBluescriptⅡSK(+)质粒上。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列的正确性;重组质粒转染C2C12细胞,RT-PCR鉴定转染细胞中hIGF-1 mRNA的表达;Western Blod鉴定转染细胞中hIGF-1的表达。结果:重组质粒PBS-RSKA/hIGF-1酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。转染细胞RT-PCR及Western Blot有特异条带出现且差异显著。结论:成功构建携RSKA/hIGF-1杂交基因的重组质粒并在C2C12细胞中正确表达。第二部分:聚乙烯亚胺介导的RSKA/hIGF-I基因延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究周围神经高位损伤后,修复后疗效较差,主要原因之一是肌肉获得神经再支配前已经萎缩;因此,如何预防失神经肌肉的萎缩,已经成为研究的热点。随着基因技术的不断发展,使失神经肌萎缩的基因治疗成为可能,本实验即是在成功构建真核高效表达质粒PBS-RSKA/hIGF-1的基础上,将其转染到失神经支配的腓肠肌内,探讨基因治疗失神经肌萎缩的效果。目的:观察聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)介导的RSKA/hIGF-I杂交基因在大鼠体内转染延缓失神经肌萎缩的效果。方法:体重180～200g的雄性SD大鼠72只随机分为4组:生理盐水对照组(A),RSKA/hIGF-I早期转染早期修复组(B);RSKA/hIGF-I早期转染延期修复组(C)、延期转染延期修复组(D)。所有大鼠均建立右侧坐骨神经损伤模型,转染治疗组于伤侧腓肠肌中央多点注射PBS-RSKA/hIGF-1/PEI混合试剂,对照组以生理盐水代替PBS-RSKA/hIGF-1注射。转染后分别于1、5、12周检测坐骨神经传导速度、腓肠肌复合动作电位、腓肠肌最大强直张力,腓肠肌湿重、腓肠肌肌细胞横截面积,hIGF-1 RT-PCR和ELISA并观察hIGF-1免疫组化染色。结果:①大体形态:延期修复组在神经修复1周时腓肠肌形态较同期对照组和早期修复转染组明显萎缩,但随着时间的延长,在12周时延期修复组形态优于对照组,稍差于即时修复转染组。②电生理学指标:坐骨神经传导速度、腓肠肌复合动作电位及腓肠肌最大强直张力在神经修复后1、5、12周时恢复由优到差依次为:B组、C组、D组、A组。③腓肠肌湿重和腓肠肌肌细胞横截面积在神经修复后1、5、12周时, B组优于A组, C组优于D组,D组优于A组。④hIGF-1免疫组化染色、mRNA RT-PCR和IGF-1 ELISA表明:重组质粒转染1周后,IGF-1的表达明显高于对照组,5W、12W IGF-1表达相对有所降低,但转染组仍高于对照组。结论:PEI介导的RSKA/hIGF-I杂交基因体内转染可以有效延缓骨骼肌失神经萎缩。

RSKA/hIGF-Ⅰ真核表达质粒延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究

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