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超声联合LHRHa靶向脂质微泡介导野生型p53基因转染卵巢癌A2780/DDP细胞的实验研究

作　者: 郭娟
导　师: 常淑芳
学　校: 重庆医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 靶向脂质微泡 LHRHa 超声 基因转染 卵巢癌
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分LHRHa靶向脂质微泡的制备及其体外寻靶鉴定目的制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,采用免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。第二部分不同超声强度及微泡浓度对卵巢癌A2780/DDP细胞活性的影响目的探讨不同超声强度及微泡浓度对A2780/DDP细胞生长活性的影响,筛选出最优的超声微泡参数组合,为后续基因转染实验奠定基础。方法1.将A2780/DDP细胞分为9个实验组,分别给予0.5W/cm~2 (30s,50s,70s),1.0W/cm~2 (30s,50s,70s),1.5W/cm~2 (30s,50s,70s),以未处理细胞为对照组, MTT法检测不同超声强度及时间对A2780/DDP细胞生长活性的影响。筛选出对细胞活性无明显影响的超声强度及时间。2.将A2780/DDP细胞分为3个实验组,将微泡浓度与细胞浓度比例调成10:1、15:1、20:1,联合筛选的超声强度及时间作用于实验组,以未处理组为对照组,MTT法检测各组细胞的生长活性,筛选出对A2780/DDP细胞的活性影响较小的超声参数与微泡浓度组合。结果1.声强0.5W/cm~2,30s的超声辐照,细胞存活率>90%。2.与细胞浓度比为10:1的微泡浓度联合0.5W/cm~2,30s的超声辐照,细胞存活率>90%。结论超声联合微泡辐照A2780/DDP细胞对其增殖具有抑制作用,且随着超声强度、时间及微泡浓度的增加,对细胞增殖抑制作用也随之增大。为了在不明显影响细胞生长活性的前提下进行基因转染,我们选择0.5 W/cm~2,30s的超声参数联合与细胞浓度比为10:1的微泡浓度作为后续基因转染实验的条件。第三部分超声联合LHRHa靶向微泡介导野生型p53基因转染A2780/DDP细胞及转染后对细胞凋亡的影目的以第二部分筛选的辐照参数作用于A2780/DDP细胞,探讨超声联合LHRHa靶向脂质微泡介导野生型p53基因转染的有效性,及转染后对细胞凋亡的影响。方法1.将A2780/DDP细胞分为6组:A:质粒组;B:非靶向微泡+质粒组;C:靶向微泡+质粒组;D:超声+质粒组;E.超声+非靶向微泡+质粒组;F.超声+靶向微泡+质粒组,分别在各实验组加入相应的处理因素,荧光显微镜下观察各组细胞的荧光表达,采用流式细胞仪比较各组转染率,RT-PCR对wtp53mRNA表达进行半定量分析。2.将A2780/DDP细胞分为7组:A.空白组;B.超声组;C:超声+非靶向微泡组D:超声+靶向微泡组E:超声+质粒组F.超声+非靶向微泡+质粒组G:超声+靶向微泡+质粒组,分别在各组加入相应的处理因素,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.将A2780/DDP细胞分为2组:A:超声+靶向微泡+质粒组B:空白对照组,对细胞进行相应处理后,采用流式细胞仪检测细胞周期,透射电镜观察细胞凋亡情况。结果1.倒置荧光显微镜下观察超声+靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组均见较多明亮的绿色荧光细胞,超声+质粒组仅见极少量荧光细胞,其余各组几乎见不到荧光细胞。2.流式细胞仪检测转染率:超声+靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组其wtp53基因转染率分别为(43.90±6.19)%和(25.33±响4.44)%,两者相比,差别有统计学意义(P<0.05),超声联合质粒组转染率仅(7.24±5.15)%,其余各组转染率均<1%;3.RT-PCR结果显示:超声+LHRHa靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组均可检测到较高wtp53mRNA表达,两者相比,前者高于后者,差异有统计学意义(P<0.05),超声+质粒组仅检测到极低wtp53mRNA表达,其余各组未检测到wtp53mRNA表达。4.流式细胞仪检测细胞凋亡率:超声+LHRHa靶向微泡+质粒组和超声+非靶向微泡+质粒组细胞凋亡率分别为(39.67±5.95)%和(24.54±3.68)%,两者相比,差别有统计学意义(P<0.05)。6.流式细胞仪对细胞周期分析:超声联合LHRHa靶向微泡介导野生型p53基因转染至细胞后,(62.79±4.65)%的细胞滞留于G1期,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.透射电镜检测细胞凋亡:转染野生型p53基因后细胞出现凋亡,与正常细胞相比,染色质边集,核膜出芽,固缩染色质脱出形成膜包凋亡小体,胞浆内空泡增多。结论超声联合LHRHa靶向微泡可有效转染野生型P53基因至人卵巢癌A2780/DDP细胞,且转染野生型p53基因后可诱导A2780/DDP细胞凋亡,有望成为一种有效的卵巢癌靶向基因治疗方法。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-17
第一部分 LHRHa 靶向脂质微泡的制备及其体外寻靶鉴定  17-22
  1 材料与方法  17-19
  2 结果  19-20
  3 讨论  20-22
第二部分 不同超声强度及微泡浓度对卵巢癌A2780/DDP 细胞活性的影响  22-28
  1 材料与方法  22-24
  2 结果  24-26
  3 讨论  26-28
第三部分 超声联合 LHRHa 靶向微泡介导野生型 p53 基因转染 A2780/DDP 细胞及转染后对细胞凋亡的影响  28-41
  1 材料与方法  28-35
  2 结果  35-39
  3 讨论  39-41
全文总结  41-42
参考文献  42-46
附图  46-53
文献综述 超声微泡造影剂用于卵巢癌的研究进展  53-59
  参考文献  57-59
致谢  59-60
攻读硕士学位期间发表论文、参研项目等情况  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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