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白蛋白共振能量转移探针的设计、合成及表征

作　者: 廖娟
导　师: 张景勍；廖飞
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药物化学
关键词: 白蛋白荧光共振能量转移配体探针
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

以蛋白质中色氨酸或酪氨酸残基为荧光共振能量转移供体,荧光探针作为FRET接受体可进行均相亲和分析。本文建立构效关系模型预测白蛋白FRET探针的亲和力,筛选有高亲和力的FRET探针,合成并对其表征,考察其用于测定白蛋白含量的可行性。FRET探针可包含荧光团和蛋白特异性配体两部分。据蛋白质中色氨酸残基的荧光性质,符合要求的FRET探针中可用荧光团有甲萘胺、7-氨基香豆素及丹磺酰胺;考虑稳定性、溶剂效应及其激发光谱与色氨酸发射光谱的重叠度,甲萘胺更理想。脂肪酸可与白蛋白结合,可用做白蛋白的FRET探针中的配体部分。预测FRET配体与白蛋白的亲和力的模型中HSA配体解离常数-7.63~-2.49,用MM2候选FRET探针的几何构型,Chemoffice计算其ClogP、DIPY、G、HF、H及Vc等20个常见性质的定量描述符,并采用逐步回归法进行多重线性回归筛选自变量,得到预测能力最好的模型,模型中按斜率绝对值排序为ClogP>DIPY>G>HF>H>Vc。用丝氨酸、乙醇胺与乙二胺分别将萘胺和不同脂肪酸链链接,用上述优选模型预测出亲和力最高的化合物。脂肪酸链的增长,化合物的预测亲和力越高;用丝氨酸连接的化合物比乙醇胺和乙二胺连接化合物的亲和力更好。本文用三种连接方式,分别用丁酸、辛酸和月桂酸三种脂肪酸为白蛋白配体合成FRET探针,并对其进行表征。只有N-(萘替甘酰)-O-辛酰丝氨酸(NAAC-SER-CA)能与HSA或BSA发生有效的荧光共振能量转移。N-萘替甘酰丝氨酸(NAAC-SER)和N-萘替甘酰-O-辛酰乙醇胺(NAAC-EA-CA)均能能淬灭白蛋白的荧光,但是在其特有的发射波长下荧光强度无敏化增强。说明脂肪酸链对FRET探针必不可少。与NAAC-SER-CA相比,丁二酸单酰萘替乙二胺(NEDA-Su)及丁二酸单酰萘替甘酰乙二胺(NAAC-EDA-Su)与白蛋白形成复合物无明显的荧光变化,表明羧基与荧光团的距离要足够近。NAAC-SER-CA与N-萘替甘酰O-月桂酰丝氨酸(NAAC-SER-DDA)相比,只有NAAC-SER-CA能发射能量转移现象,而NAAC-SER-DDA无明显的荧光淬灭或增强,表明脂肪酸链的长度对其有一定的影响。通过上述实验,获得了有望用于白蛋白含量测定的FRET探针。

全文目录

符号说明  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
前言  12-17
  1. 基于 FRET 的均相亲和分析方法  12-15
  2.白蛋白的结构及其荧光光谱性质  15-16
  3.本文的研究内容及意义  16-17
第一部分白蛋白配体亲和力预测模型的建立和应用  17-25
  第一节建立白蛋白配体亲和力预测模型的意义  17
  第二节数据收集及整理  17-18
  第三节多重线性回归模型  18-22
  第四节模型的预测能力  22-24
  第五节白蛋白FRET 探针设计及亲和力预测  24
  第六节讨论  24-25
第二部分 FRET 探针的合成  25-31
  第一节实验材料  25-26
    1 主要仪器设备  25
    2 主要试剂  25-26
  第二节合成方案  26-27
    1 丝氨酸（SER）连接  26
    2 乙醇胺（EA）连接  26
    3 乙二胺（EDA）连接  26-27
  第三节实验方法  27-30
    1 萘替甘氨酸（NAAC）的合成  27
    2 萘替甘氨酸活化酯（NAAC-NS）的合成  27
    3 萘替甘酰乙二胺（NAAC-EDA）的合成  27-28
    4 萘替甘酰乙醇胺（NAAC-EA）的合成  28
    5 辛酸活化酯（CA-NS）的合成  28
    6 萘替甘酰乙二胺辛酰胺（NAAC-EDA-CA）的合成  28
    7 萘替甘酰乙醇胺辛酸酯（NAAC-EA-CA）的合成  28-29
    8 N-叔丁氧羰基丝氨酸（BOC-SER）的合成  29
    9 N-叔丁氧羰基丝氨酸辛酸酯（BOC-SER-CA）的合成  29
    10 丝氨酸辛酸酯（SER-CA）的合成  29-30
    11 N-萘替甘酰-O-辛酰丝氨酸（NAAC-SER-CA）的合成  30
    12 N-萘替甘酰丝氨酸（NAAC-SER）的合成  30
  第四节实验结果与讨论  30-31
第三部分 FRET 探针的表征及应用  31-43
  第一节实验材料  31-32
    1 主要仪器设备  31
    2 主要试剂  31
    3 试剂配制  31-32
  第二节实验方法  32-39
    1 定性筛选  32-37
    2 FRET 探针的优化设计  37-39
  第三节实验条件优化  39-42
    1 最适白蛋白浓度的筛选  39-40
    2 月桂酸的干扰实验  40-42
  第四节讨论  42-43
全文总结  43-45
参考文献  45-49
附图及附表  49-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间的研究成果及发表的论文目录  57

白蛋白共振能量转移探针的设计、合成及表征

内容摘要

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