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HECT类泛素连接酶Smurf1自身调控机制的研究

作　者: 沈珊
导　师: 范礼斌；张令强
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 泛素连接酶 HECT Smurf1 活性调控 分子间相互作用
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System,UPS)在很多生物过程中占有重要的作用,比如转录调控、信号传导、细胞应激、蛋白质降解等等。一般来说,蛋白质泛素化由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3通过一系列的酶促级联反应完成的。E3结合底物和E2,因此在整个蛋白质的降解过程中E3发挥了至关重要的选择性作用,决定了反应的特异性。按其结构特点,E3可以分为两类:HECT(homologous to E6AP C-terminus)结构域家族和RING(really interesting new gene)结构域家族。在人类发现的E3s中,RING结构域家族占了95%,而少量的HECT结构域家族也越来越被人们所了解。人们研究的最多的主要是HECT类E3中Nedd4家族(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)。Smurf1(Smad ubiquitin regulatory factor 1)是HECT类泛素类连接酶Nedd4家族的一员,含有N端的C2结构域,中间的WW结构域,和C端的HECT结构域。在C2C12细胞里过表达Smurf1能阻止BMP蛋白信号转导通路,引发成骨的累积;同时还发现Smurf1能泛素化降解Smad5促进肌细胞的分化。Smurf1 ?/?小鼠的表型分析表明Smurf1可以通过降解激活的磷酸化形式的MEKK2来抑制动物的骨形成,而且这种抑制作用是随年龄增加而更加明显。Smurf1通过泛素化降解Rho的降解来调控细胞极性和细胞前突的形成。这些功能都说明Smurf1在细胞代谢和肿瘤的调控都占重要的作用。目前对于Smurfs的研究主要集中在生理功能方面,而对于其自身的泛素连接酶活性的调控机制目前研究的还很少。我们实验室发现调控分子CKIP-1能增强Smurf1与底物分子的亲和力的同时也可以增强Smurf1的自身泛素化。但Smurf1的自身泛素化降解是如何发生的还不完全清楚。我们首先通过在HEK293T细胞中Myc-Smurf1-WT和Flag-Smurf1-CA共转染后发现Myc-Smurf1-WT能降低Flag-Smurf1-CA的蛋白表达水平。Smurf1-CA即699位的半胱氨酸突变为丙氨酸,丧失E3活性。Myc-Smurf1-CA不能降低Flag-Smurf1-CA蛋白表达水平。由此可见,Smurf1自身降解作用是依赖其泛素连接酶活性的。进一步通过泛素化实验,我们证明了Smurf1蛋白表达水平降低是通过依赖Smurf1的E3活性的泛素化途径实现的。通过半衰期实验发现Smurf1-WT能缩短Smurf1蛋白的半衰期,更加证明了Smurf1蛋白受到自身的影响。我们通过免疫共沉淀实验、过表达实验、MG132的阻断实验,确定Smurf1的降解区域是由WW和C2结构域介导,其降解能力可被蛋白酶体抑制剂所阻断。有研究报道如果Smurf1缺失C2结构域仍然能泛素化降解Smad7但是不能泛素化降解Smad1。本文研究了C2结构域对于Smurf1自身泛素化的作用是增强的,缺失C2结构域的Smurf1自身降解作用仍然能发生,但自身降解速度减弱。我们通过对Smurf1自身调控的研究揭示了一种新的分子间相互泛素的E3活性调控机制。Smurf1的这种分子间调控与Smurf2的分子内调控机制的不同表明高度相似的E3也可能采取不同的活性调控模式。这不但丰富了我们对泛素连接酶活性调控的认识,也为E3分子特异的小分子抑制药物的临床研发提供了重要的信息。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
英文缩略语  9-10
1 前言  10-15
2 材料与方法  15-21
3 结果  21-34
4 讨论  34-37
总结  37-38
参考文献  38-43
附录  43-47
致谢  47-49
综述  49-60
  参考文献  57-60

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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