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神经肽PACAP对眼部神经损伤修复作用的研究

作　者: 赵秀丽
导　师: 陈建苏
学　校: 暨南大学
专　业: 眼科学
关键词: 垂体腺苷酸环化酶激活肽三叉神经节细胞角膜神经视网膜神经保护
分类号: R779.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：(1)将具有神经营养及修复功能的PACAP38用于兔角膜瓣制作术后,观察角膜神经修复再生及角膜敏感度的恢复情况。比较PACAP38及PTD-PACAP38的穿角膜效率。为开发PACAP用于角膜神经再生修复奠定基础。(2)通过体外细胞实验观察PACAP38对三叉神经节细胞生长的影响,以进一步完善PACAP38对角膜神经保护作用的研究。(3)探讨MAX及PTD-MAX对MSG诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用,进行形态学与功能检测。通过玻璃体注射给药比较分析MAX及PTD-MAX两种神经肽在视网膜的分布状况。为MAX及PTD-MAX防治视网膜病变提供理论依据。方法：(1)27只新西兰白兔分3组右眼行角膜瓣手术,术后每天分别以10μmol/L、5μmol/L PACAP38或PBS滴眼,共8周。行角膜敏感度测定和NF200免疫荧光染色,评价术后不同时间角膜神经的修复情况。将标记有的FITC的PACAP38和PTD-PACAP38 (8mg/ml)用于大鼠滴眼后,抽取房水进行检测,比较分析各自穿角膜效率。(2)从2周龄新西兰白兔分离三叉神经节细胞,并在神经元基础培养液中进行培养。24 h后培养液中分别加入1μmol/L或0.1μmol/L PACAP38,空白组加PBS。每隔1天拍照观察,1周后行NF200免疫荧光染色鉴别培养的三叉神经节细胞,并用生物图像分析系统测荧光灰度值,半定量比较各组细胞生长密度。(3)大鼠玻璃体注射5μL MSG (4mM)后,第2天、第3天同样方法注射5μL MAX (100pM)各一次。PTD-MAX组和PBS组实验方法同MAX组。术后14天分别行视网膜石蜡切片H-E染色、电镜检测及视网膜电图检查,比较3组视网膜结构及功能情况。另外,以穿刺给药方式分别将5μL (8mg/ml)标记FITC的PTD-MAX及MAX注射入大鼠玻璃体,对照组注入PBS。避光放置2h后行视网膜铺片,并在荧光显微镜下观察拍照,比较各组视网膜的荧光强度。结果：(1)3组角膜敏感度随着术后时间的延长逐渐增加,10μmol/L PACAP38滴眼组恢复最快。10μmol/L组和5μmol/L组角膜敏感度值明显高于PBS组,差异均有统计学意义(分别为P=0.000<0.01,P=0.005<0.01)。角膜神经NF200免疫荧光染色示10μmol/L组角膜神经密度较5μmol/L组和PBS组高,神经干断端多膨大,以出芽方式发出细微的新生神经纤维芽。PACAP38穿角膜的效率平均为8.10%,而PTD-PACAP38的穿角膜效率平均为27.22%。(2)培养的兔三叉神经节细胞第3天开始伸出伪足状突触,突触较小和少。第6天见胞体饱满圆润,突触较多融合成片。其中PACAP38应用组胞体较大,表面光滑,只有少数细胞出现空泡及凋亡。PBS组多数细胞有空泡,胞体较扁,胞质不丰富,多数开始凋亡。NF200免疫荧光染色显示,1μmol/L PACAP38组有较多神经细胞生长,突起明显增长,呈单极或多级,较多突起相连接融合交织呈网状；PBS组胞体扁平瘦削,部分胞膜破裂显示凋亡迹象。少量伸出触角,极少细胞突触融合。0.1μmol/L PACAP38介于两者之间。1μmol/L组、0.1μmol/L组细胞均较PBS组平均荧光度值高。(3)在MSG诱导的大鼠视网膜损伤模型实验中,组织学检查显示PTD-MAX和MAX有效维持了视网膜IPL层、ONL层和INL层的细胞形态、排列结构和厚度。电镜检测表明PBS组视网膜多层结构紊乱,细胞死亡较多,可见大量细胞残骸。而PTD-MAX和MAX应用组则损伤明显减轻。各组光感受器细胞层的影响较小,内外节都较完好,无显著差异。3组中GCL层均见较多细胞空泡和细胞残骸,各组无显著差异。视网膜电图显示PTD-MAX和MAX组b波和Ops波的振幅与PBS组比较差距有统计学意义(P=0.02<0.05,P=0.04<0.05)。以上结果均以PTD-MAX保护效果较显著。视网膜铺片也显示荧光分布强度PTD-MAX比MAX高。结论：(1)PACAP38能促进角膜神经形态学上的修复和角膜敏感性功能的恢复。PTD提高了PACAP38穿透角膜的效率。(2)PACAP38能促体外培养的兔三叉神经节细胞生长分化及抑制凋亡。本研究的体内外实验均证明了PACAP具有角膜神经保护作用,表明PACAP类神经生物肽有显著的促神经再生药用价值。(2)PTD-MAX比MAX更有效减轻了MSG的视网膜毒性作用。PTD有效介导了MAX在视网膜的广泛分布,本研究为PACAP类神经肽在眼底视网膜损伤修复中的应用奠定良好基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-11
前言  11-24
  1 PACAP神经肽及其生物学功能  11-14
    1.1 PACAP及其受体的简介  11-12
    1.2 蛋白Maxadilan的简介  12-13
    1.3 蛋白转导域PTD简介  13-14
  2 眼部神经修复状况的研究  14-15
  3 PACAP生物肽在眼部神经损伤修复的应用  15-16
  4 本实验研究的目的、意义和内容  16-19
  5 参考文献  19-24
第一部分 PACAP38神经肽对角膜神经损伤修复的研究  24-35
  引言  24
  材料与方法  24-28
  结果  28-29
  讨论  29-32
  附图  32-34
  参考文献  34-35
第二部分 PACAP38对兔三叉神经节细胞生长作用的研究  35-43
  引言  35
  材料与方法  35-37
  结果  37-38
  讨论  38-40
  附图  40-41
  参考文献  41-43
第三部分 Maxadilan和PTD-Maxadilan对MSG诱导的大鼠视网膜损伤作用研究  43-58
  引言  43
  材料与方法  43-47
  结果  47-49
  讨论  49-53
  附图  53-56
  参考文献  56-58
全文结论  58-59
问题与展望  59-61
主要英文缩略词  61-62
在校期间发表文章及科研成果  62-63
致谢  63-64
特别致谢  64

神经肽PACAP对眼部神经损伤修复作用的研究

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