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锌对果蝇寿命及DNA甲基化多态性影响的初步研究

作　者: 郭欣欣
导　师: 张敏
学　校: 陕西师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 锌 果蝇 寿命 产卵量 DNA甲基化多态性
分类号: Q966
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


微量元素锌被誉为“生命的火花”,其对生物体的生长发育、生殖、衰老等方面均具有重要作用,目前已经成为微量元素功能研究的热门课题之一。DNA甲基化(Methylation)是表观遗传中研究得最为深入的一种形式,是表观遗传规律的重要机制之一,其广泛存在于细菌、植物和高等动物中。高等真核生物中,DNA甲基化调节一些重要的生物学功能,包括胚胎的正常发育、染色质结构的维持、X染色体失活、基因组印记、基因表达沉默等。果蝇作为生物学研究中最重要的模式生物之一,其很久以来被认为是一种缺乏DNA甲基化的生物,近年来才证实果蝇基因组中5’-甲基胞嘧啶残基的存在,其DNA甲基化水平在胚胎发育早期达到最高,总体水平低于脊椎动物及植物。果蝇基因组DNA甲基化模式仍存在诸多争议,其DNA甲基化功能及作用机制尚待进一步研究。另外,许多研究揭示DNA甲基化水平可受环境影响而发生改变,并通过表观遗传方式将此改变传递到子代,从而影响子代的DNA甲基化修饰模式。目前关于果蝇DNA甲基化与环境因子的关系研究国内外尚未见报道。本研究以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系为实验材料,应用改进的AFLP分子标记技术及统计分析方法,检测了不同发育时期及不同性别果蝇基因组DNA甲基化多态性,分析了不同浓度锌处理后亲代及子代果蝇寿命、产卵量,以及不同发育时期及不同性别子代果蝇基因组DNA甲基化多态性的改变,探讨了不同发育时期及不同性别果蝇基因组DNA甲基化多态性的差异,以及微量元素锌对果蝇寿命、产卵量及果蝇基因组DNA甲基化多态性的影响,并初步分析了锌影响子代果蝇寿命、产卵量及基因组DNA甲基化多态性的遗传方式。主要研究结果如下：1.采用对CpT甲基化敏感的AluI内切酶代替MseI作为AFLP技术中的高频剪切酶,与EcoR I组合,对DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增等AFLP技术中的关键环节进行优化,最终建立和优化了适合果蝇DNA甲基化多态性研究的AFLP实验体系。即EcoRⅠ/Alu I双酶切,总体积为20μL,两种酶用量分别为3 U,37℃酶切12 h,65℃变性10min; 10μL连接体系中包含T4连接酶1 U, EcoR I接头5 pmol, Alu I接头50 pmol,4℃连接12h,65℃变性10 min; 25μL预扩增体系中包含Mg2+ 1.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、TaqDNA聚合酶2U、模板2.5μL、A-00 50 ng、E-00 50 ng;预扩增产物稀释100倍后进行选择性扩增,25μL选择性扩增体系中含Mg2+ 1.0 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、Tap DNA酶1.5 U、模板2.0μL、E+3 40 ng、A+3 40 ng。从64对选择性扩增引物中筛选出带型分布均匀、条带多态性高且分辨率强的12对引物用于果蝇DNA甲基化多态性研究。2.0～3h胚胎、6～9h胚胎、12～15h胚胎、18～21h胚胎、三龄幼虫、蛹等不同发育时期果蝇基因组DNA甲基化修饰存在差异,多态性条带多集中在胚胎时期,而胚胎各时期多态条带比率差异不大；三龄幼虫及蛹DNA甲基化多态条带数目较少,与胚胎期相比,差异极显著；雌、雄果蝇基因组DNA扩增出差异条带,表明黑腹果蝇DNA甲基化修饰存在性别差异,多态条带比率显著低于胚胎各时期。3.以适当浓度锌培养基(Zn浓度分别为2.5%、5%、10%)培养果蝇,引起亲代(Fo代)果蝇寿命显著延长,产卵量也较对照组显著增加；锌物质浓度过高(25%)则导致果蝇寿命降低并且丧失生殖能力。表明适当浓度的锌物质可使果蝇寿命延长,生殖能力增强。4.以适当浓度锌培养基(Zn浓度分别为2.5%、5%、10%)培养果蝇,导致其F1代果蝇寿命较对照组显著延长,产卵量显著提高,表明微量元素锌对果蝇寿命及生殖能力的影响至少可延续到子一代。5.以适当浓度锌培养基(Zn浓度分别为2.5%、5%、10%)培养果蝇,其子代0-3 h胚胎、三龄幼虫、蛹及雄果蝇DNA甲基化多态条带比率均无显著变化；5-8 h胚胎DNA甲基化多态条带比率在三个实验组F1-1、F1-2、F1-3中均显著高于对照组；与对照组相比,实验组F1-2(锌浓度2.5%)受锌物质影响最大,在5-8 h胚胎、12-15 h胚胎、18-21 h胚胎及雌蝇中DNA甲基化多态条带比率均显著高于对照组。表明适当浓度的锌物质处理后,可提高子代果蝇基因组DNA甲基化多态性。果蝇作为无脊椎动物的模式生物,研究外界环境因子对其寿命、生殖能力及基因组DNA甲基化的影响及其遗传稳定性,将为DNA甲基化模式、甲基化功能研究及动物对环境刺激的生物反应及防护研究提供重要的实验依据,为人类表观遗传研究及其与环境因子的关系等方面研究开辟新的途径。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 前言  11-21
  1.1 微量元素锌浅析  11-13
    1.1.1 锌在动物体内的催化、调节功能  11-12
    1.1.2 锌与动物体的生长、发育及衰老  12
    1.1.3 锌与动物体的生殖  12
    1.1.4 锌与动物体的免疫  12-13
  1.2 真核生物DNA甲基化研究进展  13-16
    1.2.1 DNA甲基化作用机制  13-14
    1.2.2 DNA甲基化在真核生物中的分布  14
    1.2.3 DNA甲基化修饰系统简介  14-16
    1.2.4 DNA甲基化与环境的关系  16
  1.3 果蝇DNA甲基化修饰特点  16-18
    1.3.1 dDnmt2  16-17
    1.3.2 dMBD2/3  17
    1.3.3 果蝇DNA甲基化特点  17-18
  1.4 AFLP分子标记技术及其在果蝇中的应用  18-19
    1.4.1 AFLP技术简介  18-19
    1.4.2 AFLP技术在果蝇中的应用  19
  1.5 本研究的目的和意义  19-21
第二章 锌对果蝇寿命及产卵量的影响  21-34
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 实验用培养基的配制  21
    2.1.3 果蝇的扩繁  21-22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 锌处理后果蝇寿命的检测  22-23
    2.2.2 锌处理后果蝇产卵量的检测  23
  2.3 结果与分析  23-31
    2.3.1 锌对果蝇寿命的影响  23-27
    2.3.2 锌对果蝇产卵量的影响  27-31
  2.4 分析与讨论  31-32
    2.4.1 锌对果蝇寿命的影响  31-32
    2.4.2 锌对果蝇产卵量的影响  32
  2.5 结论  32-34
第三章 基于果蝇DNA甲基化多态性的AFLP体系的建立及优化  34-49
  3.1 实验材料  34-36
    3.1.1 果蝇胚胎培养基配制  34
    3.1.2 果蝇胚胎的收集  34
    3.1.3 三龄幼虫、蛹的收集  34-35
    3.1.4 主要试剂与仪器  35-36
  3.2 实验方法  36-41
    3.2.1 基因组DNA的提取  36
    3.2.2 基因组DNA的鉴定  36-37
    3.2.3 酶切  37
    3.2.4 连接  37
    3.2.5 预扩增  37-38
    3.2.6 选择性扩增  38-40
    3.2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染  40-41
  3.3 实验结果  41-45
    3.3.1 基因组DNA提取结果  41-42
    3.3.2 酶切结果  42
    3.3.3 连接结果  42-43
    3.3.4 预扩增结果  43-44
    3.3.5 选择性扩增结果  44
    3.3.6 AFLP体系的验证  44-45
    3.3.7 引物筛选结果  45
  3.4 讨论  45-48
    3.4.1 DNA提取方法的改良  45-46
    3.4.2 限制性内切酶的选择  46-47
    3.4.3 酶切与连接  47
    3.4.4 预扩增与选择性扩增  47-48
    3.4.5 变性聚丙烯凝胶电泳及银染  48
  3.5 结论  48-49
第四章 锌对不同发育时期果蝇DNA甲基化多态性的影响  49-60
  4.1 实验材料  49
  4.2 实验方法  49-52
    4.2.1 不同发育时期果蝇的收集  49
    4.2.2 基因组DNA提取及鉴定  49
    4.2.3 AFLP技术流程  49-51
    4.2.4 数据统计方法  51-52
  4.3 结果与分析  52-57
    4.3.1 不同发育时期果蝇基因组DNA甲基化多态性结果  52-54
    4.3.2 锌对不同发育时期果蝇基因组DNA甲基化多态性的影响  54-57
  4.4 分析与讨论  57-59
    4.4.1 不同发育时期果蝇DNA甲基化多态性  57-58
    4.4.2 锌对不同发育时期果蝇DNA甲基化多态性的影响  58-59
  4.5 结论  59-60
参考文献  60-67
附录  67-76
致谢  76-77
攻读硕士学位期间研究成果  77

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中图分类: > 生物科学 > 昆虫学 > 昆虫生物化学
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