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拟南芥DSP4淀粉结合域的结构特征和定点突变研究

作　者: 刘惠
导　师: Lubomir Sokolov；李朋富
学　校: 南京大学
专　业: 生物学、植物学
关键词: 拟南芥淀粉 DSP4 淀粉结合域同源建模定点突变
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

淀粉是高等植物体内最主要的碳储存形式,叶绿体中淀粉的降解与磷酸酶密切相关。DSP4就是结合在叶绿体淀粉表面上最重要的磷酸酶之一。它含有一个C-末端催化结构域(PTP)和一个N-末端淀粉结合域(SBD)。PTP结构域主要起去磷酸化作用,SBD主要参与淀粉颗粒的结合。DSP4是目前为止发现的双特异性磷酸酶(DSPs)家族中唯一能直接影响淀粉颗粒形态结构的酶。研究表明,野生型拟南芥(WT)中淀粉颗粒呈扁平椭圆状,而淀粉过量表达突变体dsp4中由于敲除了DSP4,其叶淀粉颗粒偏圆形,颗粒直径明显变大。目前关于DSP4的结构和性质,尤其是其SBD的结构和性质,包括其如何与淀粉结合并调控淀粉颗粒降解的过程并不清楚,参与淀粉结合的氨基酸残基位点亦鲜有研究。本课题根据DSP4的基因序列信息,通过对TAIR.PDB等数据库进行BLAST搜索和数据统计分析、Clustal X多序列比对,得到与DSP4 SBD相似度最高的结构模板——AMPKβ2的GBD(糖原结合域),其PDB ID为2F15。根据同源建模的原理,利用MODELLER 9v6建立了DSP4 SBD的3D模型,预测了模型中的淀粉结合位点和钙离子结合位点。该结构模型具有典型的C2-结构域特征,含有3个碳水化合物结合域(CBR1～3).其中CBR3含有2个与淀粉结合紧密相关的氨基酸残基位点(D311、E313),且D311和E313还参与构成了SBD结构中的Ca2+结合位点Site I.在In vitro实验中,分别突变CBR3区域内的位点D311、E313为中性氨基酸A,同时设置非CBR3区域内的定点突变E305A、D328A以及具有100%进化保守性的定点突变W314S为对照,并利用Escherichia coli异源表达纯化了这几种突变型DSP4。纯化后的突变型DSP4分成两组进行淀粉结合实验：其中一组直接与淀粉颗粒进行孵育,从而对比考察野生型与突变型DSP4的活性；另一组在淀粉孵育缓冲液中额外添加不同浓度Ca2+,用以研究钙离子对突变型DSP4淀粉结合能力的影响。Western blot结果显示：与野生型DSP4相比,突变型E305A与淀粉结合的能力未受到明显影响,突变型D328A的酶活则降低,突变型D311A、E313A、W314S的淀粉结合能力完全丧失,表明位点D311、E313、W314对维持DSP4与淀粉的结合至关重要。当在淀粉孵育缓冲液中补加5mM的Ca2+时,位点D311、E313、W314被突变后的突变型DSP4能重新获得绝大部分淀粉结合能力,表明Ca2+有助于DSP4与淀粉的结合。在In vivo实验中,将D311、E313、W314分别被定点突变后的DSP4基因与GFP基因在拟南芥突变体dsp4中融合表达,构建了转基因植株GFP::D311A/dsp4、GFP::E313A/dsp4和GFP::W314S/dsp4,同时还构建了GFP::DSP4/dsp4作为阳性对照。荧光显微镜检测结果显示：与阳性对照植株GFP::DSP4/dsp4中提取的叶淀粉颗粒能检测到明亮的GFP荧光相比,从GFP::D311A/dsp4、GFP::E313A/dsp4和GFP::W314S/dsp4中分离纯化的淀粉颗粒没有观察到明显的GFP荧光,这与In vitro淀粉孵育实验结果一致,从而进一步验证了D311、E313确实是DSP4 SBD中直接参与淀粉结合的氨基酸位点。通过扫描电子显微镜(SEM)对淀粉颗粒形态结构进行观测,发现GFP::D311A/dsp4和GFP::E313A/dsp4中的叶淀粉颗粒形态几乎没有变化,与野生型淀粉颗粒一样呈现出扁平椭圆形,颗粒较小,并未如dsp4的淀粉颗粒一样偏大,且为圆形,表明DSP4中的氨基酸位点D311和E313与淀粉颗粒的形态无关。本研究深化了对DSP4结构和功能的认识,为进一步阐明淀粉的降解过程奠定了基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
缩略词  9-10
第一章文献综述  10-28
  1 蛋白质三维结构研究进展  10-15
    1.1 蛋白质三维结构的实验测定方法  10-11
    1.2 蛋白质三维结构预测的理论基础及方法  11-12
    1.3 MODELLER同源建模  12-14
    1.4 SBD三维结构研究进展  14-15
  2 植物淀粉代谢调控研究进展  15-19
    2.1 植物淀粉的组成及形态结构  15
    2.2 植物淀粉的合成  15-16
    2.3 植物淀粉的降解  16-17
    2.4 DSP4与淀粉代谢的联系及其研究进展  17-19
  3 Ca~(2+)在植物体中的生理功能  19-20
  4 本课题的研究内容与意义  20-21
    4.1 前期研究工作简述及有待解决的问题  20-21
    4.2 研究目的  21
    4.3 研究内容  21
  参考文献  21-28
第二章拟南芥DSP4淀粉结合域的结构预测及分析  28-45
  1 引言  28
  2 数据库及软件  28
  3 实验方法  28-31
    3.1 获取DSP4的基因序列及亚细胞定位分析  28-29
    3.2 DSP4结构域及进化分析  29-30
    3.3 DSP4SBD保守氨基酸残基位点预测  30
    3.4 DSP4DSP和SBD的3D结构预测及评估  30
    3.5 Ca~(2+)结合位点预测  30-31
  4 实验结果与分析  31-41
    4.1 DSP4序列信息和亚细胞定位结果  31
    4.2 DSP4结构域分析  31-32
    4.3 DSP4进化分析  32-34
    4.4 DSP4SBD关键氨基酸残基位点预测  34-36
    4.5 DSP4DSP和SBD的3D结构预测  36-39
    4.6 Ca~(2+)结合位点预测  39-41
  5 本章讨论与小结  41-43
  参考文献  43-45
第三章拟南芥DSP4淀粉结合域的定点突变研究  45-72
  1 引言  45
  2 材料和仪器  45-51
    2.1 主要试剂  45-46
    2.2 主要仪器和设备  46
    2.3 主要溶液的配制  46-49
    2.4 基因克隆和表达技术原理及克隆载体  49-51
  3 实验方法  51-64
    3.1 In vitro DSP4 SBD功能研究  51-62
    3.2 In vivo DSP4 SBD功能研究  62-64
  4 实验结果与分析  64-69
    4.1 RNA电泳结果和pCR8-DSP4质粒的构建  64
    4.2 In vivo DSP4蛋白诱导及纯化结果  64-65
    4.3 突变型DSP4与淀粉的结合能力  65-66
    4.4 Ca~(2+)对DSP4功能的影响  66-67
    4.5 荧光显微镜结果  67-68
    4.6 SEM结果  68-69
  5 本章讨论与小结  69-70
  参考文献  70-72
全文总结  72-73
致谢  73-74

拟南芥DSP4淀粉结合域的结构特征和定点突变研究

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