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日本血吸虫23kDa膜蛋白与人免疫球蛋白的相互作用分析

作　者: 武闯
导　师: 姜宁
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫 Sjc23-LED抗原 ELISA Pull-Down 人非免疫IgG 重合肽定位免疫逃避
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 55次
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内容摘要

血吸虫病是世界范围内对人类健康威胁最严重的寄生虫病之一,流行于76个国家和地区,至少2亿人及大量牲畜被其感染,受威胁人口逾7亿。其中日本血吸虫是血吸虫中生物学特性最复杂、危害最严重、防治难度最大的一种,也是我国唯一一种感染人的血吸虫。相对于化疗短期的治病效果,免疫可提供长期的保护力,因此疫苗的研制和应用被认为是控制疫病的根本手段之一。多年来,人们在抗虫疫苗上进行了大量尝试,但效果均不理想。目前疫苗研究的方向,多为亚单位疫苗,其关键步骤是对血吸虫保护性抗原的筛选,然而此工作一直进展缓慢,其中一个重要原因是对虫体的免疫逃避机制和参与宿主的免疫调节过程缺少认识。日本血吸虫23kDa膜蛋白(Sjc23)是四跨膜蛋白(TSP)家族的一员,在虫体生活史各阶段的膜表面均有表达,直接暴露于宿主的免疫系统,是宿主对虫体免疫应答的首要靶标,是目前公认的几种具有潜力的候选疫苗和具有诊断价值的抗原分子之一。对血吸虫膜相关蛋白的研究不仅可为疫苗候选抗原的筛选提供依据,也对血吸虫与宿主相互作用和疾病诊断的研究有着重要意义。本研究以日本血吸虫成虫DNA为模板,PCR扩增出编码Sjc23大胞外区(Sjc23-LED)的基因,构建表达载体pET-22b-Sjc23-LED,转化基因工程菌BL21(DE3),诱导表达出含有6×His标签的可溶性蛋白,并用His GraviTrap非变性亲和层析镍柱纯化出具有生物学活性的蛋白质。用Sjc23-LED与弗氏佐剂混合免疫BALB/c小鼠,发现其具有较强的免疫原性,诱导产生了高水平的抗体。抗体分型结果表明免疫后小鼠血清中的抗体一直是IgG2a亚型,而自然感染小鼠虽然也一直以IgG2a抗体为主,但在感染后期出现了IgG1型抗体,且抗体效价随时间的延长而逐渐升高。这表明Sjc23抗原激发产生以IgG2a为主的非细胞嗜性抗体,同时抑制机体对其它抗原的应答,其自身可能是与血吸虫免疫逃避相关的抗原分子。鉴于正常患者血清与Sjc23有较强的粘附作用,本研究首先用ELISA法检测人血清成分——IgA、IgE、IgG、IgM、白蛋白与Sjc23-LED的粘附情况,结果仅有IgG与Sjc23-LED具有亲和力。为了进一步验证二者结合的特异性,我们采用Pull-Down的方法,将重组蛋白固定在His GraviTrap磁珠上,构成“诱饵”蛋白,捕获可与其特异性结合的蛋白分子,进一步用洗脱剂将蛋白复合物洗脱下来进行Western Blot鉴定。结果依然是Sjc23-LED仅与非免疫人IgG具有亲和力。该方法较ELISA受干扰因素少且要求配体-受体间具有更强的亲和力,因此更具说服力。日本血吸虫是一种人兽共患寄生虫,同样也威胁着畜牧业的发展。因此我们对疫区常见家畜牛和猪的IgG与Sjc23-LED的亲和力进行了研究。ELISA和Pull-Down结果都显示Sjc23-LED与猪IgG微弱结合、与牛IgG不结合,这表明Sjc23对宿主的免疫调节作用具有宿主差异性,血吸虫对动物机体的适应程度可能要弱于人类。为了对Sjc23-LED与非免疫人IgG相互作用的位点进行定位,我们先用ELISA和Pull-Down的方法证明Sjc23-LED与Fc片段发生粘附。接着我们根据Sjc23-LED的氨基酸序列设计了7段重合肽,在Pull-Down实验中分别用这些肽段封闭人IgG的结合位点以抑制其与Sjc23-LED结合。结果肽段3、4显示出抑制作用,即两段肽段所共有的9氨基酸序列(-KIQTSFHCC-)介导了Sjc23-LED与人IgG的粘附。Sjc23-LED的三级结构预测显示,这9个氨基酸位于第二个螺旋,其后端保守而前端与家族其他成员不同,Sjc23-LED的三级结构与CD81、SjcTSP-2的差异也标志着其可能具有和其他TSP家族成员不同的生物功能。本研究首次确定了血吸虫配体表位和人类宿主受体之间的相互作用：Sjc23与宿主的免疫系统相互作用,迅速诱导产生低亲和力的抗体,从而抑制宿主对其他抗原的免疫反应,是一个参与免疫逃避的调节抗原,可能并不适宜作为日本血吸虫病的候选疫苗和诊断抗原分子。

日本血吸虫23kDa膜蛋白与人免疫球蛋白的相互作用分析

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