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一氧化氮对桃果实ETR1蛋白原核表达及李果实线粒体膜氧化损伤的影响

作　者: 姚婷婷
导　师: 周杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 分析化学
关键词: 一氧化氮 桃 乙烯受体蛋白 基因克隆 原核表达 李 线粒体膜 抗氧化酶 活性氧 氧化损伤
分类号: TS255.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 38次
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内容摘要


本文分为两部分,第一部分内容是对桃果实中的乙烯受体蛋白进行原核表达,并优化了蛋白表达条件,初步探索了NO对乙烯受体基因转录表达的影响;第二部分内容研究了一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响。克隆了与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,获得ETR1重组蛋白并优化ETR1的表达条件,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增到一条约2500 bp的特异片段,将该片段克隆到pEASY-T1上,经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后,克隆到pET15b并转染Ecoli C43（DE3）,IPTG诱导表达ETR1重组蛋白并优化其表达条件。序列分析结果表明,该序列与GenBank中的AF124527的cDNA序列同源性99%,氨基酸序列同源性99%。诱导ETR1重组蛋白的优化条件为:大肠杆菌选用C43（DE3）,IPTG的终浓度为0.5 mmol·L-1,适宜诱导温度为30 oC,适宜诱导时间为8 h。在本实验优化的条件下,ETR1重组蛋白在大肠杆菌C43（DE3）中的成功表达,为ETR1的重组生产和对ETR1功能的体外研究提供了条件。随着NO浓度的增加,对ETR1基因表达的抑制作用也更加显著。分别用0、10、15、30μL·L-1 NO处理李果实,测定25℃贮藏13 d内果实呼吸速率、活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性、线粒体通透性转换孔开放程度、膜电位、膜流动性、细胞色素（Cyt） c/a的变化。与对照和其它NO处理相比,15μL·L-1 NO提高了果实中SOD、CAT和POD活性,有效减少了果实中氢过氧化物和超氧阴离子自由基等ROS的含量,抑制了线粒体通透性转换孔的开放,延缓了线粒体膜通透性的升高和Cyt c的释放,维持了较高的膜电位。随着浓度升高,30μL·L-1 NO对线粒体膜的保护作用降低。

全文目录


中文摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
1 引言  12-31
  1.1 一氧化氮  12-16
    1.1.1 NO 在植物体内的产生  12-15
      1.1.1.1 依赖于一氧化氮合成酶（NOS）的生成途径  13-14
      1.1.1.2 依赖于硝酸还原酶(NR)的生成途径  14
      1.1.1.3 非酶促的NO 生成途径  14-15
    1.1.2 NO 在植物体内的调节作用  15-16
      1.1.2.1 NO 介导脱落素诱导的气孔关闭  15
      1.1.2.2 NO 与抗氧化酶的关系  15
      1.1.2.3 NO 和乙烯的相互作用  15-16
  1.2 乙烯  16-25
    1.2.1 乙烯的生物合成  17
    1.2.2 乙烯的生理效应  17-18
    1.2.3 乙烯信号转导  18-23
      1.2.3.1 乙烯反应突变体  18-20
      1.2.3.2 乙烯信号转导模型  20
      1.2.3.3 乙烯转导途径中各个因子的上下关系  20-23
    1.2.4 乙烯受体的研究现状  23-25
      1.2.4.1 乙烯受体家族  23-24
      1.2.4.2 乙烯受体蛋白  24-25
  1.3 线粒体  25-28
    1.3.1 线粒体结构特点与功能  26
    1.3.2 线粒体通透性转变孔  26-28
  1.4 细胞色素c-凋亡起始因子  28-29
  1.5 论文研究内容及意义  29-31
2 材料与方法  31-43
  2.1 试材与试材处理  31-32
  2.2 仪器与试剂  32-35
  2.3 试验方法  35-43
    2.3.1 乙烯受体蛋白的原核表达及NO 对乙烯受体基因的影响  35-40
      2.3.1.1 特异性引物设计  35
      2.3.1.2 RNA 提取  35
      2.3.1.3 总浓度测定  35
      2.3.1.4 cDNA 第一链的合成  35-36
      2.3.1.5 梯度PCR  36
      2.3.1.6 回收目的DNA 片段  36-37
      2.3.1.7 克隆载体的构建及鉴定  37-39
      2.3.1.8 原核表达载体构建及鉴定  39
      2.3.1.9 目的基因的诱导表达条件的优化及可溶性分析  39
      2.3.1.10 含重组质粒的大肠杆菌的繁殖培养  39
      2.3.1.11 大肠杆菌的破碎和目的蛋白的获得  39-40
      2.3.1.12 ETR1 蛋白的组氨酸激酶活性  40
      2.3.1.13 NO 乙烯受体基因的扩增的影响  40
    2.3.2 一氧化氮对采后李果实线粒体膜氧化损伤的影响  40-43
      2.3.2.1 果实呼吸速率  40
      2.3.2.2 超氧自由基和氢过氧化物含量的测定  40
      2.3.2.3 抗氧化酶活性测定  40-41
      2.3.2.4 线粒体的提取和活性测定  41
      2.3.2.5 线粒体膜通透性转换孔（MPTP）的测定  41
      2.3.2.6 细胞色素Cyt c/a 测定  41
      2.3.2.7 线粒体膜流动性检测  41-42
      2.3.2.8 线粒体膜电位的测定  42-43
3 结果与分析  43-56
  3.1 乙烯受体的纯化与NO 对乙烯受体基因转录的影响  43-50
    3.1.1 桃果实RNA 的完整性  43
    3.1.2 RT-PCR  43-44
    3.1.3 ETR1 基因的扩增  44-45
    3.1.4 ETR1 基因的扩增及原核表达载体的构建  45-46
    3.1.5 融合蛋白诱导表达条件优化体系的建立及蛋白可溶性分析  46-48
    3.1.6 ETR1 蛋白的组氨酸激酶活性  48-49
    3.1.7 NO 饱和溶液处理对基因表达的影响  49-50
  3.2 一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响  50-56
    3.2.1 NO 对果实呼吸速率、超氧阴离子和氢过氧化物含量的影响  50-52
    3.2.2 NO 对SOD、CAT 和POD 活性的影响  52-54
    3.2.3 线粒体膜变化  54-56
4 讨论  56-59
  4.1 乙烯受体蛋白的原核表达及NO 对乙烯受体基因表达的影响  56-57
  4.2 一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响  57-59
5 结论  59-60
6 创新之处  60-61
参考文献  61-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的学术论文目录  72

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 水果、蔬菜、坚果加工工业 > 基础科学
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