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体外蛋白复性中小分子添加剂的作用及其过程分析研究

作　者: 余秀娟
导　师: 王骊丽
学　校: 西北大学
专　业: 分析化学
关键词: 小分子添加剂 蛋白质复性与纯化 溶菌酶 重组人Flt3配体 蛋白质构象
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


到目前为止,在复性液中添加小分子试剂是提高体外辅助蛋白复性效率的策略之一。其目的是为了降低蛋白复性过程中聚集形式的形成,从而促进变性蛋白质向天然和活性构象的转变。这种方法在一定程度上能够提高蛋白质的复性效率并且得到了长足的发展。为了捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律,明确小分子添加剂对体外辅助蛋白质分子折叠过程的机制,本论文将以蛋清溶菌酶为模型标准蛋白,以大肠杆菌(E.coli)表达的重组人Flt3 (rhFL)为模型包涵体蛋白,利用不同复性方法和荧光光谱技术,研究三种小分子添加剂对蛋白质复性的影响,分析其复性过程中复性效率和荧光强度变化与复性蛋白构象的关系,初步推测一些小分子添加剂辅助蛋白质色谱复性过程中构象变化规律,为解决包涵体蛋白难于复性和复性效率低的问题提供可靠的数据,并起到指导性的作用。论文包括四个部分：1.文献综述：对近年来蛋白质的复性,包括蛋白质的预处理、体外辅助蛋白质复性的方法和不同小分子添加剂在蛋白质复性过程中作用的进展进行了综述。2.稀释法辅助溶菌酶复性及其构象的荧光表征：以天然态的溶菌酶(Lys)作为标准模型蛋白,采用稀释复性方法,考察复性过程中小分子添加剂对蛋白质复性产物的活性回收率和荧光光谱的影响,分析小分子添加剂与溶菌酶构象变化的规律及其辅助复性的作用机制。3.高效疏水色谱法辅助溶菌酶复性及其构象的荧光表征：以还原变性的Lys作为日标蛋白,采用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)法,考察流动相中添加不同浓度的脲、谷胱甘肽(还原型和氧化型)、L-精氨酸时,在HPHIC色谱饼上复性前后的质量回收率、活性回收率以及荧光光谱的变化,分析小分子添加剂对还原变性的Lys复性的影响以及其作用机制。结果表明,这些小分子添加剂均可不同程度的提高蛋白复性效率。对复性产物进一步鉴定和分析发现,还原变性的Lys在色谱柱上的复性与稀释法复性过程中的复性效率、荧光光谱以及构象变化规律一致。4. HPHIC法辅助rhFL复性与同时纯化的研究：将E.coli所表达的rhFL包涵体菌体细胞经离心、超声波破碎、多次粗纯化后,溶解于8 mol/L脲中。采用HPHIC法,考察在流动相中添加脲、谷胱甘钛(还原型和氧化型)及L-精氨酸时,不同种类和浓度的小分子添加剂对rhFL包涵体蛋白复性与同时纯化效率的影响。并利用荧光光谱技术,进一步考察了日标蛋白复性前后荧光强度的变化与复性效果规律。结果表明,添加浓度为3 mol/L脲、1.8 mmol/L/0.3 mmol/L谷胱甘肽(还原型/氧化型)及0.5 mol/L的L-精氨酸时,可以使rhFL的质量回收率提高38.4%,有利于恢复其生物活性。该结果可为rhFL蛋白药物的研发奠定基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 文献综述  11-23
  1.1 前言  11
  1.2 变性蛋白质的来源及制备  11-13
    1.2.1 标准蛋白质作为复性研究的模型  11-12
    1.2.2 大肠杆菌中包涵体蛋白的回收及溶解  12-13
  1.3 体外辅助蛋白质复性的方法  13-18
    1.3.1 传统体外辅助蛋白质的复性  13-14
    1.3.2 体外辅助蛋白折叠液相色谱法  14-18
  1.4 小分子添加剂在蛋白体外复性中的作用  18-19
  1.5 蛋白质复性效果的评价方法  19-22
    1.5.1 蛋白复性过程中构象表征的方法  19-21
    1.5.2 蛋白复性产物鉴定的方法  21-22
  1.6 本论文的研究工作  22-23
第二章 稀释法辅助溶菌酶复性及其构象的荧光表征  23-32
  2.1 引言  23-24
  2.2 仪器与试剂  24
    2.2.1 实验仪器  24
    2.2.2 实验试剂  24
  2.3 实验方法  24-25
    2.3.1 还原变性Lys的制备  24
    2.3.2 稀释法复性还原变性Lys  24-25
    2.3.3 Lys活性测定及计算方法  25
    2.3.4 Lys的荧光光谱测定  25
  2.4 结果与讨论  25-30
    2.4.1 荧光光谱表征还原变性Lys复性过程动力学变化  25-26
    2.4.2 脲浓度对Lys复性的影响  26-27
    2.4.3 稀释倍数对Lys复性的影响  27
    2.4.4 氧化还原环境对Lys复性的影响  27-28
    2.4.5 不同pH值对Lys复性的影响  28-29
    2.4.6 不同浓度L-精氨酸对Lys复性的影响  29-30
  2.5 小结  30-32
第三章 高效疏水色谱法辅助溶菌酶复性及其构象的荧光表征  32-41
  3.1 引言  32-33
  3.2 仪器与试剂  33-34
    3.2.1 实验仪器  33-34
    3.2.2 实验试剂  34
  3.3 实验方法  34-35
    3.3.1 还原变性Lys的制备  34
    3.3.2 HPHIC色谱法复性还原变性Lys  34-35
    3.3.3 Lys的荧光光谱  35
    3.3.4 Lys质量回收率的测定  35
  3.4 结果与讨论  35-40
    3.4.1 添加脲对Lys复性的影响及其荧光结构表征  35-37
    3.4.2 氧化还原环境对Lys复性的影响及荧光性质的表征  37-38
    3.4.3 添加L-精氨酸对Lys复性的影响及其荧光结构表征  38-40
  3.5 小结  40-41
第四章 HPHIC法辅助rhFL复性与同时纯化的研究  41-55
  4.1 引言  41-42
  4.2 仪器与试剂  42-44
    4.2.1 实验仪器  42
    4.2.2 实验仪器  42-44
  4.3 实验方法  44-45
    4.3.1 FL蛋白的发酵培养  44
    4.3.2 rhFL包涵体的回收与溶解  44
    4.3.3 HPHIC法复性与纯化rhFL包涵体  44-45
    4.3.4 复性与纯化rhFL的分析与鉴定  45
    4.3.5 rhFL的荧光光谱分析  45
  4.4 结果与讨论  45-54
    4.4.1 脲浓度对rhFL复性与同时纯化的影响及其构象表征  45-47
    4.4.2 氧化还原环境对rhFL复性与同时纯化的影响  47-49
    4.4.3 L-Arg对rhFL复性与同时纯化的影响  49-51
    4.4.4 小分子添加剂对FL影响的比较图谱  51-53
    4.4.5 电泳结果  53-54
  4.5 小结  54-55
参考文献  55-63
论文总结  63-64
硕士期间发表论文情况  64-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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