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固定金属离子亲和蛋白质芯片的洗脱行为研究

作　者: 杜涛
导　师: 赵胜利
学　校: 河南科技大学
专　业: 材料学
关键词: 蛋白质芯片再生洗脱吸附制备
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着蛋白质组学技术的发展,基于蛋白芯片的表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱将色谱分离和蛋白质谱两项技术合为一体,快速分析各种生物样品中蛋白质的组成。蛋白质芯片在疾病相关分子的发现、诊断、预防以及新药开发等领域有着极强的优越性,在很多领域有着广阔的发展前景,特别在恶性肿瘤标志物的筛选方面已得到广泛的应用。蛋白质芯片价格昂贵,并且主要为一次性用品,没有再生利用,限制了它的使用和推广,也给医务工作者和患者带来了不便。本文采用磷酸盐洗脱液与硼酸盐洗脱液再生已使用过的IMAC-Cu蛋白质芯片,研究了缓冲溶液浓度、pH值、洗脱时间和竞争洗脱剂对洗脱-吸附效果的影响,同时考察了硅氧化物薄膜为固相载体经化学修饰后对蛋白质的吸附行为。通过JSM-5610LV型扫描电镜(SEM)分析蛋白质芯片的表面形貌,利用美国Ciphergen生物系统公司的表面增强激光解析离子化/飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)检测再生后芯片表面蛋白质的吸附效果。研究结果表明:洗脱液中加入磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液对IMAC-Cu蛋白质芯片的再生具有促进作用。随着磷酸盐洗脱液pH值的降低或硼酸盐洗脱液pH值的升高,芯池表面所吸附的蛋白质更容易被去除,但对芯片的化学结构的破坏性也随之加剧。同时,洗脱时间越长,蛋白质芯片的洗脱效果越好,但时间过长,芯片表面破损严重,综合考虑蛋白质去除效果以及芯片结构的完整性等多种因素,洗脱时间为72h时效果较好。磷酸盐洗脱液或硼酸盐洗脱液中加入竞争洗脱剂甘氨酸(Gly)、硫酸铵((NH4)2SO4)或乙二胺四乙酸(EDTA)可明显增强对IMAC-Cu芯片上蛋白质的洗脱效果。其中,在磷酸盐洗脱液中以EDTA为竞争洗脱剂更有利于全部去除芯片表面所吸附的蛋白质,而在硼酸盐洗脱液中两种竞争洗脱剂均可全部去除吸附的蛋白质,但使用EDTA再生后吸附效果更好。经含0.02mol/L EDTA,pH值为5.0的磷酸盐洗脱溶液处理已使用过的蛋白质芯片72h,可使其完全再生。多种溶液再生蛋白质芯片时,依次使用磷酸盐洗脱液与硼酸盐洗脱液洗脱效果较好。经以EDTA为竞争洗脱剂的磷酸盐洗脱液与硼酸盐洗脱液依次各处理36h时,芯片表面的蛋白质可完全去除,再生后芯片蛋白质吸附量也较高。以绒面硅氧化物(SiOx)为固相载体,对其表面进行醛基化处理有利于金属离子螯合剂保持更多的极性原子,增强载体对蛋白质的吸附能力。相对光滑与多孔表面载体,所制备的绒面载体蛋白质芯片具有较大的表面积,可吸附蛋白质种类较多,吸附量也较大。另外,已使用过的蛋白质芯片经超声和羟基化等步骤后,可使芯池上原有化学链断裂,并重新生长具有一定蛋白质吸附能力的化学链。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-8
第1章绪论  8-19
  1.1 引言  8
  1.2 蛋白质芯片的分类与原理  8-9
  1.3 蛋白质在IMAC 中吸附与解吸的影响因素  9-13
    1.3.1 固定金属离子  10-11
    1.3.2 竞争洗脱剂与溶液pH 值  11
    1.3.3 螯合剂  11-12
    1.3.4 离子强度  12-13
  1.4 蛋白质芯片技术的构成  13-17
    1.4.1 芯片制备  13-14
    1.4.2 蛋白质芯片技术在癌症研究中的新进展  14-17
  1.5 课题研究意义及研究内容  17-19
第2章实验方法  19-21
  2.1 原料及仪器  19-20
  2.2 表征设备  20-21
    2.2.1 扫描电子显微镜(SEM)  20
    2.2.2 表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱仪(SELDI-TOF-MS)  20-21
第3章单种溶液再生蛋白质芯片  21-34
  3.1 实验  21-22
    3.1.1 磷酸盐洗脱溶液配制  21
    3.1.2 硼酸盐洗脱溶液配制  21-22
    3.1.3 样品的制备  22
  3.2 结果与讨论  22-33
    3.2.1 磷酸盐洗脱液对IMAC 蛋白质芯片再生的影响  22-28
    3.2.2 硼酸盐洗脱液对IMAC 蛋白质芯片再生的影响  28-33
  3.3 本章小结  33-34
第4章多种溶液再生蛋白质芯片  34-41
  4.1 引言  34
  4.2 实验  34-35
    4.2.1 溶液的配制  34
    4.2.2 样品的表征  34-35
  4.3 结果与讨论  35-39
    4.3.1 两种溶液洗脱  35-37
    4.3.2 三种溶液洗脱  37-39
    4.3.3 蛋白质芯片的再生次数  39
  4.4 本章小结  39-41
第5章蛋白质芯片的制备  41-49
  5.1 引言  41
  5.2 实验  41-42
    5.2.1 溶液的配制  41
    5.2.2 热氧化法制备硅氧化物薄膜  41
    5.2.3 实验步骤  41-42
  5.3 结果与讨论  42-48
    5.3.1 硅氧化物薄膜腐蚀机理  42-43
    5.3.2 载体表面修饰及蛋白质螯合机理  43-44
    5.3.3 载体的表面形貌对蛋白质螯合量的影响  44-45
    5.3.4 醛基化过程对蛋白质螯合量的影响  45-46
    5.3.5 蛋白质芯片制备  46-48
  5.4 本章小结  48-49
第6章结论  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56
攻读硕士学位期间的研究成果  56

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