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Notch信号在牙髓损伤修复中的作用研究

作　者: 马亮
导　师: 张亚庆；王胜朝
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: Notch相关基因小鼠牙乳头细胞MDPC-23 内毒素脂多糖(LPS) DAPT 成牙本质细胞损伤修复
分类号: R781.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牙齿发生和牙髓损伤修复均受到众多信号分子的精密调控。前期研究表明,Notch信号通路在进化上高度保守,它可以通过局部细胞间相互作用传导信号,调控细胞的增殖、分化、凋亡等多种生命过程,最终决定多细胞动物发育过程中多种细胞的命运。本研究拟从体外、体内两方面进行实验。首先利用致龋菌的毒力因子脂多糖LPS刺激小鼠成牙本质细胞样细胞系MDPC-23,从而探讨成牙本质细胞在受到外界致龋菌毒力因子刺激下其Notch相关基因的表达情况。接着,通过构建大鼠牙髓炎模型,从而探讨Notch受体在牙髓损伤修复过程中的动态表达模式。最后,我们通过抑制Notch信号继而探讨其对成牙本质样细胞分化的影响。所取得的研究结果如下:1牙髓损伤细胞模型建立及NOTCH信号表达检测1)牙髓损伤细胞模型的建立利用不同浓度的LPS刺激MDPC-23细胞系,并进行MTT检测。结果表明,当LPS浓度超过1μg/ml且对MDPC-23细胞作用72h时,表现为毒性作用。24h后,各浓度LPS对细胞增殖有明显促进作用(P<0.05)。48h后,10ng/ml～1μg/ml组与对照组相比没有明显区别(P>0.05),5μg/ml组对细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.05)。72h后,各实验组与对细胞增殖均为抑制作用,其中1μg/ml和5μg/ml组抑制作用显著(P<0.05)。通过对细胞增殖活力的检测,初步确定了合适的LPS浓度,为进一步的研究打下了基础。2) LPS刺激对MDPC-23细胞中Notch信号相关基因表达的影响利用合适浓度的LPS刺激MDPC-23细胞系,进行Real-time PCR检测。结果显示,在对照组中,Notch1表达平稳并呈轻微上升趋势,当用10ng/ml～1μg/ml的LPS作用后,Notch1的表达先升高,而后逐渐下降。Jagged1和Delta1在对照组中均表现出下降趋势;Jagged1加入100ng/ml～1μg/ml LPS后,1～3d表达为上升趋势,3～5d表达为下降趋势; Delta1在加入10ng/ml～1μg/ ml的LPS后表现为0～3d表达逐渐下降,3～5d逐渐上升。Hes1在对照组中表达先轻微上升而后基本平稳;当加入10ng/m和100ng/ml的LPS后, 0～5d表达逐渐升高;当加入1μg/ml的LPS时,0～1d表达逐渐升高,而1～5d逐渐下降。通过对Notch相关基因表达量的研究,探讨在牙髓损伤修复中各基因的动态变化,我们得出结论,一定浓度LPS刺激可使MDPC-23中Notch信号分子表达升高,Notch信号通路在维系细胞功能平衡、启动细胞应激反应有重要意义。2 Notch受体在牙髓损伤动物模型中的动态表达分析通过构建大鼠实验性牙髓炎模型,我们探讨了Notch2的表达情况,牙髓损伤早期(3d),牙髓细胞中Notch2呈弱阳性表达,成牙本质细胞阴性表达。牙髓损伤中期(5d),成牙本质细胞深层细胞Notch2阳性表达达到高峰。牙髓损伤晚期(7d),Notch2在牙髓细胞中表达减弱,而在成牙本质细胞中表达高峰。牙髓损伤末期(14d),Notch2仅在成牙本质细胞下层细胞中尚有微弱表达,而其余牙髓细胞均为阴性表达。而对于LPS刺激组,3d～7d内Notch2染色程度均明显高于单纯机械损伤组。对照组正常牙髓组织Notch2表达为阴性。通过体内试验我们得出,机械损伤可以诱导Notch2在牙髓间充质细胞和成牙本质细胞中表达,同时LPS的刺激作用可以加剧应激反应并提高Notch2的表达水平。Notch信号对牙髓损伤修复起到了重要作用。3抑制Notch信号对小鼠牙乳头细胞系MDPC-23分化潜能影响的初步分析。为了进一步说明Notch信号对牙乳头细胞向成牙本质细胞分化中起到的作用,我们对小鼠牙乳头细胞系MDPC-23进行矿化诱导,并向诱导液中加入不同浓度的Notch信号抑制剂DAPT,从而观察在Notch信号被抑制的条件下MDPC-23细胞的碱性磷酸酶表达变化以及形成矿化结节的改变。结果显示,DAPT抑制Notch信号后,MDPC-23细胞的ALP活性及矿化结节形成能力均有所降低。这些结果提示,Notch信号的存在可能有助于促进MDPC-23细胞分化。综上所述,牙齿发育中细胞的多样性是以Notch信号所介导的旁侧分化为基础的,当成牙本质细胞在牙髓受到损伤时发生凋亡,此时牙髓间充质细胞就会开始启动自我分化并逐渐形成新生的成牙本质样细胞,继而分泌形成修复性牙本质。Notch信号通路可以在牙髓损伤修复动态过程中激活表达,体现了一种在组织修复过程早期的分子反应机制。本研究认为,在体外细胞实验中发现Notch受体以及配体Jagged1对细胞分化具有负向调节作用,而配体Delta1则对细胞分化具有正向调节作用。同时,抑制Notch信号可以降低MDPC-23细胞的矿化形成能力,即抑制了其向成牙本质样细胞分化的能力。体内研究中发现,牙髓受到刺激后,Notch的表达强度呈现出随时间的动态变化,体现了Notch首先对外界急性刺激的一个应激反应,产生对成牙本质细胞的一个保护性的抑制凋亡的作用。本研究认为,Notch信号的再激活对于平衡牙髓损伤修复过程中所涉及到的细胞增殖,分化以及凋亡三者之间的相互关系起到了重要作用。

全文目录

缩略语表  6-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-15
前言  15-16
文献回顾  16-25
正文  25-51
  第一部分牙髓损伤细胞模型中NOTCH相关分子表达分析  25-34
    实验一牙髓损伤细胞模型的建立  26-30
      1 材料  26-27
      2 方法  27
      3 结果  27-29
      4 讨论  29-30
    实验二 LPS刺激对MDPC-23细胞中Notch信号相关基因表达的影响  30-34
      1 材料  30
      2 方法  30-31
      3 结果  31-33
      4 讨论  33-34
  第二部分 NOTCH受体在牙髓损伤动物模型中的动态表达分析  34-45
    大鼠牙髓炎模型的构建及Notch2的动态表达分析  34-45
      1 材料  35
      2 方法  35-37
      3 结果  37-43
      4 讨论  43-45
  第三部分抑制NOTCH信号对小鼠牙乳头细胞系MDPC-23分化潜能影响的初步分析  45-51
    1 材料  46-47
    2 方法  47
    3 结果  47-49
    4 讨论  49-51
小结  51-53
参考文献  53-58
临床病例汇报  58-71
个人简历和研究成果  71-72
致谢  72

Notch信号在牙髓损伤修复中的作用研究

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