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平邑甜茶GLB1基因的克隆、表达及其功能的研究

作　者: 史兴征
导　师: 彭福田；姜远茂
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 平邑甜茶 MhGLB1 非共生血红蛋白 H2O2 NO 低氧胁迫
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

模式植物研究发现GLB1编码非共生血红蛋白,该蛋白的主要功能包括以下几个方面:（1）因为和氧的亲和力强,所以可能起到清除氧的作用。（2）通过与黄素蛋白（类似于细菌和酵母体内的黄素血红蛋白）的相互作用用参与电子传递。（3）结合一些已知的配体（O₂,NO和CO）,作为感受机制的一部分,比如针对配体水平的波动而调节细胞内的代谢。（4）与有机小分子结合,在脂肪酸的运输中起作用或者参与低氧条件下的有机物的合成。为探讨GLB1在果树抵抗非生物胁迫中的分子生物学功能,以水培平邑甜茶实生苗为试材,克隆了非共生血红蛋白-1的编码基因,同时采用实时荧光定量PCR研究了MhGLB1基因在NO₃^-、SNP、低氧胁迫及ABA处理下表达量的变化,并构建了MhGLB1的正义表达载体,成功转化了番茄,初步研究了其生理生化功能,主要结果如下:1.根据已知苹果GLB1基因的EST序列,设计特异引物利用PCR技术获得非共生血红蛋白-1的全长编码区,命名为MhGLB1,GenBank注册号为GQ423619。序列分析表明,MhGLB1基因编码区477bp,共编码158个氨基酸,预测分子量为17.8kDa。同时MhGLB1的氨基酸序列分析显示该基因与梨（Pyrus communis）、棉花（Gossypium hirsutum）、苜蓿（Medicago sativa）的非共生血红蛋白的同源性分别为95.57%、82.82%、80.12%;系统进化树分析显示,MhGLB1基因与梨的同源关系最近。故进一步确定其为平邑甜茶非共生血红蛋白-1的编码基因。2.荧光定量PCR分析MhGLB1基因在不同组织中的表达发现,MhGLB1在平邑甜茶的根、茎、叶中均有表达,且在根中的表达量最大。对MhGLB1基因在不同环境条件下在不同组织中的表达特性的研究结果显示:硝态氮处理增加了MhGLB1在根、茎、叶中的表达,且在根中MhGLB1的含量2h时就明显升高,茎和叶中MhGLB1的表达量是缓慢增加的;在SNP处理下,MhGLB1的表达量2h时已迅速增加,4h时表达量比峰值下降50.8%,但仍高于对照,之后又有所增加;ABA处理4h能够使MhGLB1的含量显著高于对照,用c-PTIO预处理后再用ABA处理时,MhGLB1的含量与对照差异不显著。3.为进一步研究平邑甜茶GLB1的生理生化功能,将非共生血红蛋白-1的编码基因,构建了pBI121- MhGLB1正义表达载体,并对番茄进行农杆菌侵染的遗传转化。对转基因番茄的抗涝性进行了初步检测发现:与野生型植株（WT）相比,转基因番茄（1号和5号）在水涝下其光合速率下降比较缓慢。在淹水24h时野生型植株光合速率、气孔导度、蒸腾速率分别下降了86%、86.8%和90.7%,而转基因植株1号和5号则分别下降了40.1%、72.5%、78.7%以及55.3%、70.2%、82.8%,96h时H₂O₂和NO的含量也都显著低于对照。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-20
  1.1 植物血红蛋白的研究概况  12-14
  1.2 缺氧胁迫下植物nsHbs 对NO 的调节  14-16
  1.3 低氧胁迫下植物nsHbs 对H_20_2的调节  16-17
  1.4 目前已获得的血红蛋白转基因植物  17-18
  1.5 本研究的目的和意义  18-20
2. 材料与方法  20-34
  2.1 实验材料  20-23
    2.1.1 植物材料与处理  20-21
    2.1.2 菌株与质粒  21
    2.1.3 酶及生化试剂  21
    2.1.4 PCR 引物  21
    2.1.5 培养基  21-23
  2.2 实验方法  23-34
    2.2.1 植物材料总 RNA 的提取  23-24
    2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成  24
    2.2.3 cDNA 全长基因序列的获得  24-25
    2.2.4 DNA 片段与克隆载体的连接  25
    2.2.5 凝胶电泳中 DNA 片段的回收  25-26
    2.2.6 碱法小量质粒 DNA 的提取  26-27
    2.2.7 DNA 序列测定  27
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  27-28
    2.2.9 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备与转化  28
    2.2.10 基因组 DNA 提取（CTAB 法）  28-29
    2.2.11 MhGLB1 正义表达载体的构建  29-30
    2.2.12 实时荧光定量 PCR  30-31
    2.2.13 ‘S 以12 粉’番茄的转化  31-32
    2.2.14 转基因植株的检测  32
    2.2.15 转基因植株抗涝性的测定  32
    2.2.16 本研究使用的软件  32-34
3 结果与分析  34-48
  3.1 平邑甜茶GLB1 全长cDNA 的分离  34
  3.2 非共生血红蛋白基因（MhGLB1）的序列分析  34-38
  3.3 基因表达特性分析  38-42
    3.3.1 MhGLB1 在不同组织中的表达  38-39
    3.3.2 硝态氮处理对MhGLB1 在不同组织中的表达的影响  39-40
    3.3.3 NO 释放剂（SNP）处理对MhGLB1 在根中的表达的影响  40-41
    3.3.4 低氧胁迫对MhGLB1 在根中表达的影响  41
    3.3.5 ABA 处理对MhGLB1 在根中表达的影响  41-42
  3.4 转基因番茄表达载体p81121-MhGLB1 的构建及转基因番茄的鉴定.  42-46
  3.5 正义转基因番茄抗涝性的测定  46-48
4 讨论  48-52
  4.1 MhGLB1 基因编码平邑甜茶非共生血红蛋白-1  48
  4.2 MhGLB1 的表达特性  48-49
  4.3 GLB1 在植物耐低氧胁迫中的功能  49-52
5 结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
硕士在读期间形成的论文  61

平邑甜茶GLB1基因的克隆、表达及其功能的研究

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