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杂色鲍微卫星DNA标记筛选和广东沿海养殖群体遗传多样性分析

作　者: 许新
导　师: 区又君；陈刚
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 杂色鲍微卫星标记遗传多样性养殖群体
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 57次
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内容摘要

20世纪80年代末杂色鲍因其生长较快而成为我国南方最主要的养殖鲍。在鲍养殖业迅速发展的同时,由于海洋环境污染,养殖群体遗传结构单一、近交机率增加,同时,海域养殖过度、养殖污染,赤潮频发等外在因素更是严重的制约了鲍养殖业可持续发展。如何增强鲍的抗逆能力,提高其品质和质量,改良种质资源状况已经成为当前我国重要的研究课题。随着分子生物学技术的不断发展完善,分子标记技术不仅用于遗传多样性调查和种群遗传结构分析,也为种质评价、鉴别、溯源提供了条件,同时,也为分子标记辅助育种技术体系的建立奠定了基础。本论文以中国重要海洋经济贝类杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)为对象,研究了杂色鲍微卫星标记的分离,分析了杂色鲍养殖群体的遗传多样性与遗传分化,主要研究结果如下:(1)由于有关杂色鲍在公共数据库中的基因序列信息比较少,特别是EST序列,且有关杂色鲍的微卫星标记研究方面几乎是空白。故本实验室构建了杂色鲍的肌肉组织和内脏组织的cDNA文库,构建了一个高质量的cDNA文库。共测序获得了8016个表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST),经聚类分析共得到1087个contigs和3694个singletons序列,既4781个unigene序列。比对分析显示1882个EST序列在GenBank数据库中没有同源性,占EST总数的23.5%;2899个EST序列在数据库中有同源序列,占EST总数的36.2%。(2)从4781个unigene序列中,经过软件筛选发现161个ESTs序列共含有173个微卫星,占整个EST序列的3.72%。双碱基重复序列110个,占63.6 % ;三碱基类型的47个,占约27.2 %.从161个含有微卫星的EST序列中初步选取141条序列用引物设计软件prime prime 5进行微卫星引物设计。其中51对序列由于没有足够的侧翼序列不能用来设计引物,共设计93对引物由上海生工合成。在93对引物中,78对引物扩增出微卫星条带,其他15对引物在不同的温度和Mg2+浓度下不能得到扩增产物(无扩增产物、杂带过多或只能在部分个体中出现扩增产物)。在这78对可扩增的引物中,有53对的扩增产物是预期片段,25对引物的产物远超过预期片段可能是错配的缘故。我们用这53对引物通过上述选取的8个个体用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测多态性。通过检测,19对引物具有多态性。用40个采集样品检测的结果显示每个位点的等位基因数从2个到16个不等,平均为7.84个;观测杂合度介于0.412-0.748之间,期望杂合度的变化范围为0.653-0.846。(3)以7个养殖群体分别来自广东汕头(ST,36个体),汕尾(SW,36个体),惠东(HD,36个体),湛江(ZJ,36个)和徐闻(XW,36个体,深圳野生驯养(SY,36个体)和日本(RB,36个体。实验所采取汕头,汕尾和惠东养殖群体为汕头与日本千叶杂交一代群体的杂交群体。利用7个微卫星位点ZSB2 ,ZSB4,ZSB6,ZSB8,ZSB10,ZSB13和ZSB17的引物进行了遗传多样性和种群遗传结构分析,统计分析了等位基因数、基因频率、杂合度、平均多态信息含量等遗传参数,并检测了群体是否符合Hardy-Weinberg平衡的状况。结果显示:7个位点产生的等位基因数从8-16个不等,共检测到76个等位基因,平均每个位点10.87个。有效等位基因数目范围为3.8-10.8,平均观察杂合度范围0.472-0.914,平均期待杂合度范围为:0.748-0.920。7个群体的每个位点多态信息含量变化范围为0.645-0.889,PIC值均在0.500以上,表现为高多态。相比两个野生驯养的养殖群群体而言,其他5个养殖群体整体存在不同程度的遗传多样性的降低。本研究中Fst值的范围为0.013-0.167。两个野生驯养的养殖群体之间以及与养殖群体之间Fst值都大于0.08,表明两野生驯养的养殖群体与养殖群体之间都存在明显的遗传分化。养殖群体遗传距离与地理距离不相关,可能是杂色鲍人工养殖过程中各育苗厂之间亲鲍和苗种频繁交流交换所造成的结果.从总体上说,杂色鲍养殖群体目前仍具有较高的遗传多样性,遗传信息丰富,遗传变异大,可以作为良好的育种材料.

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
1 文献综述  12-31
  1.1 遗传多样性的研究  12-19
    1.1.1 遗传多样性的定义及研究意义  12
    1.1.2 遗传多样性的检测方法  12-14
    1.1.3 几种分子标记技术的发展概况  14-18
    1.1.4 各种分子标记的比较  18-19
  1.2 微卫星分子标记的发展进程  19-24
    1.2.1 微卫星的定义，分类及在基因中的分布  19-20
    1.2.2 微卫星多态性及其产生机理  20-22
    1.2.3 微卫星标记主要步骤及其优缺点  22-24
  1.3 微卫星DNA 筛选方法研究进展  24-25
    1.3.1 构建小插入片段基因组文库筛选微卫星DNA  24
    1.3.2 构建微卫星富集文库筛选微卫星DNA  24
    1.3.3 从公用数据库中筛选微卫星DNA  24
    1.3.4 利用近源种之间引物的通用得到目的物种的微卫星标记  24-25
  1.4 微卫星 DNA 在贝类分子遗传学中的研究进展  25-28
    1.4.1 群体遗传多样性的检测  25-26
    1.4.2 微卫星标记在亲缘关系鉴定中的应用  26-27
    1.4.3 遗传图谱的构建  27
    1.4.4 分子标记辅助选择  27-28
  1.5 鲍的养殖及遗传育种（现状）概况  28-30
    1.5.1 鲍的生物学特征及养殖现状  28
    1.5.2 鲍的遗传育种研究现状  28-30
  1.6 研究的目的和意义  30-31
2 杂色鲍 cDNA 文库构建和 EST 序列分析  31-43
  2.1 材料试剂与设备  31-32
    2.1.1 实验材料  31
    2.1.2 主要化学试剂  31-32
    2.1.3 主要仪器设备  32
  2.2 试验方法  32-35
    2.2.1 实验用品预处理  32
    2.2.2 cDNA 文库构建  32-35
  2.3 测序及EST 分析  35-36
  2.4 结果与分析  36-40
    2.4.1 总RNA 的提取  36
    2.4.2 mRNA 的分离  36
    2.4.3 均一化  36-37
    2.4.4 连接转化与菌落鉴定  37
    2.4.5 插入片段鉴定结果  37
    2.4.6 EST 测序及结果分析  37-40
  2.5 讨论  40-43
3 杂色鲍微卫星DNA 标记的筛选  43-60
  3.1 材料与方法  43-52
    3.1.1 实验材料及模板DNA 提取  43-45
    3.1.2 微卫星序列的筛选  45
    3.1.3 微卫星引物设计  45-51
    3.1.4 微卫星引物的优化与筛选  51-52
    3.1.5 数据分析  52
  3.2 结果  52-58
    3.2.1 EST-SSRs 筛选结果  52-54
    3.2.2 引物设计和优化结果  54-58
  3.3 讨论  58-60
4 养殖群体遗传多样性分析  60-72
  4.1 材料与方法  60-63
    4.1.1 实验材料  60-61
    4.1.2 DNA 提取与SSR 扩增  61-62
    4.1.3 数据统计处理  62-63
  4.2 结果  63-69
    4.2.1 PCR 扩增结果及多态性  63-64
    4.2.2 群体内遗传多样性  64-65
    4.2.3 哈迪.温伯格平衡检验  65
    4.2.4 群体遗传结构  65-66
    4.2.5 群体间的遗传差异  66-67
    4.2.6 遗传距离与聚类分析  67-69
  4.3 讨论  69-72
    4.3.1 群体内的遗传多样性  69-70
    4.3.2 哈迪—温伯格平衡  70
    4.3.3 遗传变异和遗传分化  70-72
5 小结与展望  72-73
参考文献  73-84
致谢  84-86
附录  86-88
作者简介  88-89
导师简介  89

杂色鲍微卫星DNA标记筛选和广东沿海养殖群体遗传多样性分析

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