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强化融合蛋白Fv-LDP-AE体外活性研究及产生融合蛋白Fv-LDP的重组菌E.coli BL21（DE3）Star～（TM）/pEFL高密度发酵

作　者: 高瑞娟
导　师: 甄永苏；李电东
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 融合蛋白 高密度发酵 重组菌 博士论文 医科大学 活性研究 工程菌 发酵培养基 培养基成分 协和
分类号: TQ464
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


抗体的人源化、高效化、小型化以及新的分子靶点的开发是当今抗体药物的的主要研究趋向。单抗导向药物借助抗体部分与靶抗原部分的特异性结合，将某些生物活性物质导向肿瘤靶部位而发挥抗瘤效应。Ⅳ型胶原酶高表达于人体多种实体瘤组织，是一个值得研究分子靶点。LDM属于烯二炔类抗生素，具有强烈的杀伤癌细胞和独特的DNA切割活性。LDM由烯二炔发色团和辅基蛋白两部分构成，二者可拆分和重建。LDM目前已完成Ⅰ期临床研究。Fv-LDP是运用基因工程技术构建的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv与LDM辅基蛋白LDP形成的融合基因经pEFL质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）StarTM中以包涵体形式表达的融合蛋白。融合蛋白Fv-LDP可通过分子强化手段与LDM活性型发色团AE结合而形成强化融合蛋白Fv-LDP-AE。因此，Fv-LDP-AE既具有潜在的Ⅳ型胶原酶靶向性和特异结合性，又具有LDM强烈细胞毒作用。本研究主要包括两部分：强化融合蛋白Fv-LDP-AE的抗肿瘤活性和融合蛋白Fv-LDP产生菌E．coliBL21（DE3）StarTM／pEFL的高密度发酵。一强化融合蛋白Fv-LDP-AE抗肿瘤活性研究DNA切割实验表明，通过分子强化获得的强化融合蛋白Fv-LDP-AE具有剂量依赖性损伤DNA的能力。在无还原剂的条件下，Fv-LDP-AE切割质粒DNA的有效浓度为1.95×10-8 M／0.45μg DNA，LDM的有效切割浓度为2.5×10-8 M／0.45μg DNA。而且，Fv-LDP-AE和LDM作用裸基因组DNA均形成弥散状条带。这些结果表明，强化融合蛋白Fv-LDP-AE承袭了LDM直接切割DNA的能力。我们还观察了强化融合蛋白Fv-LDP-AE对不同肿瘤细胞的抗瘤活性。MTT分析显示，Fv-LDP-AE对人高转移性巨细胞肺癌PG细胞、人低转移性肺腺癌PAa细胞和人肝癌BEL-7402细胞的IC50分别为1.47×10-10 M，1.57×10-9 M、1.10×10-10 M，而LDM对相应细胞的IC50为2.41×10-10 M，2.91×10-9 M，1.61×10-10 M，提示Fv-LDP-AE在体外的抑瘤活性较LDM略强，可能与强化融合蛋白中scFv的作用有关。用本实验浓度Fv-LDP-AE和LDM分别处理PG细胞、PAa细胞和BEL-7402细胞4 h，继续培养至72 h，发现，Fv-LDP-AE与LDM类同，能明显诱导各细胞裂亡，其主要特征为：细胞体积增大，核增大、G2+M期阻滞，细胞多核化等。Hoechst 33342和PI双染还可观察到一种与典型凋亡不同的染色质凝集方式：核膜基本保持完整，细胞贴壁，染色质散点状凝集，形成多核，多核化细胞形态各异，发生频率亦不相同。1nM Fv-LDP-AE致BEL-7402细胞产生细胞裂亡的潜力较LDM强，可使71％的细胞形成多核，而等浓度LDM仅能使58.0％的细胞出现DNA多倍性。对于同样处理的PG细胞，0.1nM的两种药物均能使大于40％的细胞多核化，但随着药物浓度的升高，多核化细胞比例逐渐下降。药物致PAa细胞多核化比例较低，最高达34.8％，等浓度Fv-LDP-AE较LDM促进细胞多核的效果好。这些结果说明，多核化频率因细胞种类不同而异。除裂亡外，0.1-1nM Fv-LDP-AE和LDM处理4h，继续培养72h的PG细胞和BEL-7402细胞中还发生了细胞凋亡。大约20％或更少的PG细胞凋亡，但琼脂糖凝胶电泳未检测到DNA梯带，提示凋亡的PG细胞可能处于早期阶段。流式分析表明，与对照组相比，Fv-LDP-AE和LDM处理的BEL-7402细胞产生了典型的凋亡亚G1峰，在0.1-1nM范围内，Fv-LDP-AE致细胞凋亡百分比高于等浓度LDM，且均随药物浓度增大而降低，琼脂糖凝胶电泳呈现典型DNA梯带。PAa细胞中未发现典型的凋亡现象。Fv-LDP-AE和LDM还影响细胞周期进程。0.1nM Fv-LDP-AE和LDM分别使56.9％和60.7％的PG细胞阻滞于G2+M期，而0.5nM和1nM的Fv-LDP-AE和LDM则致PG细胞阻滞于G2+M期和S期，其致S期阻滞的最大百分比分别为69.1％和79.4％。在0.1-1nM范围内，Fv-LDP-AE和LDM致PAa细胞产生G2+M期和S期阻滞。本实验浓度处理的BEL-7402细胞由于细胞大量凋亡和裂亡的影响，处于周期中的细胞较少，失去周期分析的可行性。SA-β-gal染色分析显示，Fv-LDP-AE和LDM作用过的细胞出现衰老样表型，且二者对同种细胞的SA-β-gal染色阳性率相仿，说明其作用在肿瘤细胞衰老途径中的差异不大。此外，LDM处理的肝癌BEL-7402细胞中端粒酶活性显著降低（P＜0.01），可能在细胞裂亡和衰老形态中起关键作用。详细机制有待进一步研究。二融合蛋白Fv-LDP产生菌E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL高密度发酵高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个有效手段。高密度发酵的成功实现取决于多个因素，如菌种的稳定性、培养基组成及其配比、发酵策略等。本部分包含如下内容：1．E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL生产菌中融合蛋白Fv-LDP表达的稳定性监测基因工程融合蛋白Fv-LDP包含抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的Fv片段和高活性抗肿瘤抗生素LDM辅基蛋白LDP两部分，并于本实验室成功制备。E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL生产菌种中蛋白表达的稳定性监测是制备高品质Fv-LDP融合蛋白的必要条件。我们对冷干的菌种进行了物理、化学、微生物学以及生物学特征的检测。革兰氏染色和IMViC结果显示，该菌种符合大肠杆菌的特征。限制性酶切结果显示，EcoRⅠ切割重组质粒pEFL形成6.5kb条带，而NdeⅠ和XhoⅠ双酶切形成5.4kb空载体片段和1.1kb Fv-LDP基因片段。第100代E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL重组菌融合蛋白Fv-LDP基因测序结果与原始菌种一致。以anti-His tag为一抗的Western blot分析显示，融合蛋白Fv-LDP在不同代的E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL重组菌中稳定表达。SDS-PAGE分析显示，Ni2+-NTA金属螯合层析后的变性融合蛋白纯度达96％以上。ELISA结果表明，Fv-LDP部分保留了完整单抗3G11对人高转移性巨细胞肺癌PG细胞Ⅳ型胶原酶的抗原亲和性；明胶酶谱分析可见，Fv-LDP呈剂量依赖性抑制PG细胞中Ⅳ型胶原酶活性。总之，上述菌种特征均与原始菌一致，提示E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL菌种的稳定性较好，可用于规模发酵研究。2．融合蛋白Fv-LDP产生菌E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL培养基及培养条件的优化ChemiImager凝胶成像系统中Spot Denso软件常用于确定靶蛋白的相对量。基于此，我们以融合蛋白Fv-LDP浓度为横坐标，相应的积分光密度（IDV）为纵坐标，建立标准曲线。结果显示，在88.7-1064μg／mL范围内，Fv-LDP浓度（C）与其相应IDV（A）呈线性关系（A=222.7C，r=0.9988）。精密度试验RSD为2.09％，平均回收率为95.18％。上述结果表明，该方法适用于科研和生产过程中融合蛋白Fv-LDP的产品控制。发酵培养基成分和配比的确定以及培养条件的优化采用单因素实验和正交实验方法在摇瓶中进行。经过一系列的筛选，获得的最佳培养基配方为：国产麦芽提取物浓度为4g／L，胰蛋白胨为10g／L，酵母粉为17.5g／L，牛肉膏为2.5g／L，硫酸铵为1g／L，Na2HPO4·12H2O为1.5g／L，KH2PO4为1.5g／L，NaCl为2.5g／L，1M MgSO4·7H2O为1.5mL／L。最佳培养条件的优化使用获得的最佳培养基进行。有利于工程菌生长和Fv-LDP表达的最佳培养条件是：①采用筛选出的最佳培养基进行种子培养；②37℃恒温生长和表达；③培养基初始pH7.5；④接种量6％；⑤IPTG诱导前、后时间均为6h；⑥IPTG诱导剂浓度为0.1mM。以此条件进行的E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL可以获得大于800μg／mL的Fv-LDP融合蛋白，Fv-LDP产量约是LB培养基中的6-7倍。由此可见，培养基成分和培养条件的优化对于提高融合蛋白Fv-LDP表达水平非常必要。3．融合蛋白Fv-LDP产生菌E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL高密度发酵重组菌高密度发酵过程中会产生大量气泡，通常需要加入消泡剂。单因素实验选定0.2‰泡敌作为后续实验的消泡剂。首先在发酵罐中模拟摇瓶培养条件进行培养，发现Fv-LDP表达量较低，为403.5μg／mL，低于摇瓶中的产量，可能与溶氧水平受限制有关。为了提高溶氧水平，将重组菌分批发酵的搅拌转速设定为600rpm，Fv-LDP表达水平提升为700μg／mL，但依然不理想。为进一步提高Fv-LDP-AE产量，采用补料分批发酵方式进行发酵罐培养。恒pH补料分批发酵过程中，Fv-LDP表达量约为3g／L，但发酵过程中积累的高水平的糖和氨基氮，对E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL极为不利。为了避免葡萄糖和氨基氮水平过高给重组菌Fv-LDP表达造成的胁迫，采用分阶段恒速补料分批发酵方式进行重组菌培养。结果显示，发酵液OD600随培养时间而增加，Fv-LDP表达量也相应升高，Fv-LDP最大产量达4g／L左右；葡萄糖浓度在整个发酵过程中稍有降低，基本维持在4mg／mL的较佳水平；氨基氮水平下降，低点达15mg／100mL。这些数据表明，培养基成分得到了较充分的吸收，提示分阶段恒速补料分批培养是一个适合E．coli BL21（DE3）StarTM／pEFL生长和Fv-LDP表达的好方案。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
部分缩略语  12-14
第一部分 强化融合蛋白Fv-LDP-AE体外活性研究  14-59
  前言  14-16
  材料与方法  16-22
  实验结果  22-53
  讨论  53-55
  结论  55-56
  参考文献  56-59
第二部分 产生融合蛋白Fv-LDP的重组菌E.coli BL21(DE3)Star~(TM)/pEFL高密度发酵  59-116
  前言  59-61
  材料与方法  61-78
  实验结果  78-109
  讨论  109-112
  结论  112-113
  参考文献  113-116
文献综述1  116-125
  参考文献  122-125
文献综述2  125-139
  参考文献  134-139
致谢  139-140
附录  140-143

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产
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