学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

拟南芥PGABH和AspRS的表达分析及功能鉴定

作　者: 赵东晓
导　师: 吴长艾；郑成超
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ABA 天冬氨酰-tRNA合成酶未知功能基因生长发育
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 42次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

拟南芥PGABH基因(Post Germination ABA Hypersensitive Gene)是一个功能未知的基因。另外,氨酰-tRNA合成酶是一类催化特定氨基酸或其前体与对应tRNA发生酯化反应而形成氨酰-tRNA的酶。近年来的研究表明,氨酰-tRNA合成酶还具有基因表达调控、调节氨基酸合成、信号传导等方面的功能。天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)属于Ⅱ类氨酰-tRNA合成酶,目前关于AspRS在植物体中的新功能的研究尚未有报道。因此本实验从拟南芥PGABH基因的缺失突变体pgabh-1和AtAspRS超表达植株入手,首次对拟南芥中PGABH的功能和AtAspRS的新功能进行了初步探讨,为揭示研究两基因的功能和作用机理奠定了良好的基础。对于PGABH的研究结果如下:1. PlantCARE分析发现PGABH启动子中含有一个与ABA信号响应相关的ABRE-like元件,还含有与光调控有关的AAAC元件,G-Box元件和Sp1元件等。通过GUS染色和qRT-PCR的方法研究其组织表达模式,发现PGABH主要在拟南芥地上绿色组织,花器官中的柱头和花药中表达。qRT-PCR结果还表明PGABH在子叶生长初期表达量急剧升高,但ABA处理抑制其表达。这些结果表明PGABH可能参与了ABA介导的子叶初期生长和光调控的开花过程。2.为了研究该基因的功能,我们获得了PGABH缺失突变体pgabh-1。对突变体进行萌发实验,结果表明ABA抑制突变体pgabh-1子叶生长初期的绿化过程。3. pgabh-1在长日照条件下表现出叶片小,开花提前等表型,对开花相关基因进行了RT-PCR分析,结果表明PGABH缺失突变明显改变了开花基因CO和FT的表达,说明PGABH对开花时间的影响可能是通过调节CO和FT的表达来实现的。对于AtAspRS的研究结果如下:1.通过GUS染色和qRT-PCR的方法对AtAspRS启动子进行组织表达分析,发现AtAspRS主要维管组织,茎尖生长点,侧根中表达。2.正常生长条件下,AtAspRS超表达植株在在幼苗期幼叶黄化并最终导致植株死亡;抽薹期黄化导致花序轴变短、结实率降低。不同转基因株系出现黄化表型的几率不同,表型的出现率与AtAspRS超表达量正相关。叶绿素含量分析表明超表达AtAspRS使转基因株系的叶绿素a含量降低,表明AtAspRS超表达影响了叶绿素a的合成或加速了其降解。3.为了了解AtAspRS超表达植株黄化表型出现的原因,我们对AtAspRS转基因植株和野生型植株进行了表达谱分析,结果表明黄化的AtAspRS超表达植株体内有6193个基因的表达发生了显著的变化。这些基因参与了胁迫响应,生长发育,生物及非生物刺激响应,蛋白质代谢和基因转录等过程。其中检测到23个叶绿体基因表达相关基因均呈现下降趋势。这些结果进一步说明AtAspRS超表达影响了叶绿素的合成。

全文目录

符号说明  4-6
目录  6-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-32
  1.1 脱落酸研究进展概述  13-24
    1.1.1 脱落酸的发现  13
    1.1.2 植物体中脱落酸的作用  13-22
      1.1.2.1 促进果实成熟  13-14
      1.1.2.2 促进气孔关闭  14-16
      1.1.2.3 促进种子休眠  16-18
      1.1.2.4 提高植物抗干旱能力  18-19
      1.1.2.5 提高植物的抗低温能力  19-20
      1.1.2.6 提高植物对盐胁迫的抗性  20-21
      1.1.2.7 提高植物的抗缺素能力  21-22
    1.1.3 脱落酸受体研究进展  22-24
  1.2 氨酰-tRNA 合成酶  24-30
    1.2.1 氨酰-tRNA 合成酶的结构及分类  24-28
    1.2.2 氨酰-tRNA 合成酶的功能  28-30
      1.2.2.1 参与基因表达调控  28-29
      1.2.2.2 调节rRNA 合成  29-30
      1.2.2.3 RNA 剪切细胞因子  30
      1.2.2.4 抑制细胞凋亡  30
    1.2.3 天冬氨酰-tRNA 合成酶的研究进展  30
  1.3 本研究的目的与意义  30-32
2 材料与方法  32-46
  2.1 实验材料  32-34
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 菌株与质粒  32
    2.1.3 酶与各种生化试剂  32
    2.1.4 实验用的引物  32-34
  2.2 实验方法  34-46
    2.2.1 RNA 的提取  34-35
      2.2.1.1 利用TRIzol 法提取RNA  34
      2.2.1.2 利用通用植物总RNA 提取试剂盒（离心柱型）提取RNA  34-35
    2.2.2 RNA 中基因组DNA 的去除  35
    2.2.3 RNA 反转录  35
    2.2.4 拟南芥基因组DNA 的提取（小量法）  35-36
    2.2.5 拟南芥PGABH 和AspRS 序列的扩增  36
    2.2.6 凝胶电泳中DNA 片段的回收  36-37
    2.2.7 DNA 片段与克隆载体的连接  37
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  37-38
      2.2.8.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  37-38
      2.2.8.2 大肠杆菌细胞的转化  38
    2.2.9 克隆载体的酶切鉴定  38
    2.2.10 质粒DNA 的提取  38-39
      2.2.10.1 碱法小量质粒DNA 的提取  38-39
      2.2.10.2 碱法大量质粒DNA 的提取  39
    2.2.11 表达载体的构建  39-40
    2.2.12 植物表达载体的转化  40-41
      2.2.12.1 根癌农杆菌LBA4404、GV3101 感受态细胞的制备  40
      2.2.12.2 冻融法转化农杆菌  40-41
    2.2.13 农杆菌的培养  41
    2.2.14 农杆菌介导的拟南芥转化  41
    2.2.15 农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化  41-42
    2.2.16 转基因拟南芥PCR 检测  42-43
    2.2.17 PCR 鉴定突变体纯合植株  43
    2.2.18 qRT-PCR  43-44
      2.2.18.1 qRT-PCR 引物设计  43-44
      2.2.18.2 qRT-PCR 反应条件  44
    2.2.19 转基因拟南芥植株GUS 组织化学染色分析  44-45
    2.2.20 叶绿素含量的测定  45-46
3 结果与分析  46-60
  3.1 PGABH 的启动子分析  46
  3.2 PGABH 的表达分析  46-48
  3.3 PGABH 在拟南芥中的功能鉴定  48-53
    3.3.1 PGABH 缺失突变体pgabh-1 及互补突变体植株的获得  48-49
    3.3.2 ABA 抑制pgabh-1 子叶初期生长  49-51
    3.3.3 子叶生长初期ABA 处理使PGABH 表达下调  51
    3.3.4 PGABH 影响拟南芥植株发育及开花时间  51-52
    3.3.5 PGABH 对拟南芥中开花相关基因的调控  52-53
  3.4 AtAspRS 的组织表达分析  53-54
  3.5 AtAspRS 在拟南芥中的功能鉴定  54-57
    3.5.1 AtAspRS 超表达植株的表型  54-56
    3.5.2 AtAspRS 超表达植株中叶绿素含量测定  56-57
  3.6 AtAspRS 超表达植株的表达谱分析  57-60
4 讨论  60-62
  4.1 PGABH 介导了ABA 调控子叶初期生长过程  60
  4.2 PGABH 调控拟南芥开花时间  60-61
  4.3 AspRS 在拟南芥中的功能探究  61-62
5 结论  62-63
6 参考文献  63-74
7 附录  74-76
8 致谢  76-77
9 攻读学位期间发表论文情况  77

拟南芥PGABH和AspRS的表达分析及功能鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文