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低分子量肝素精细结构的分析研究

作　者: 吴艳芳
导　师: 朱智甲
学　校: 东华大学
专　业: 应用化学
关键词: 低分子量肝素毛细管电泳体积排阻色谱十糖精细结构
分类号: R927
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝素是由糖醛酸和氨基葡萄糖以1→4糖苷键连接的二糖重复单元组成的线性多糖,其中糖醛酸残基包括L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸,氨基葡萄糖为D-葡萄糖胺。肝素具有许多生理活性,参与细胞分化、细胞迁移、免疫等重要生理过程。由于硫酸化修饰的差异,使肝素成份非常复杂,组成成份的定量分析对于了解其生物活性、质量控制具有重要意义。低分子量肝素作为一种新型抗凝血药物被广泛用于预防和治疗术后血栓栓塞性疾病。低分子量肝素在碱性条件下发生p-消除反应降解引起特殊化学键的断裂生成1,6-成环衍生物,因此低分子量肝素与普通肝素相比结构更为复杂。然而,对于低分子量肝素类药物而言,低分子量肝素精细结构的分析研究是一项具有挑战性的工作。本论文主要从以下分为三部分研究低分子量肝素的精细结构,其具体内容和结果如下：1、本部分建立了一种新的基于毛细管电泳法测定低分子量肝素精细结构的分析方法。低分子量肝素在肝素酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ完全酶解的条件下可以得到相应的低聚糖。在120 mmol/L甲酸(pH=3.4)缓冲液条件下,这些低聚糖可以得到非常有效的分离。在缓冲液中添加1%(w/v) PEG (10000)和2 mmol/L CaCl2可以有效提高核质比非常接近低聚糖的分离度。在最佳的缓冲体系中,几乎所有低聚糖都能达到基线分离和定量测定。低聚糖的电解迁移率与其核质比呈线性关系,这有利于利用保留时间指认出色谱图上各个色谱峰。该方法重复性好,定量准确。毛细管电泳法和离子交换色谱进行比较,毛细管电泳分析低分子量肝素精细结构分辨率更高。2、本部分建立了用于分离并定量测定低分子量肝素中不同糖链长度的各个组份分布比例的体积排阻色谱方法。系统考察了流动相的组成、离子强度和pH值、流速、柱温等因素对分离的影响,确定的最佳分离条件为：两根色谱柱TSK-GEL G2000SWxl (7.8 mm×300 mm)串联,流动相100 mmol/L NH4Ac(pH=7.0),流速0.5 mL/min,柱温35℃,进样量5μL,样品浓度10 mg/mL。对方法的重现性和稳定性进行了验证,一天之内和天与天之间低分子硫酸化多糖各组成成份迁移时间和峰高的相对标准偏差分别0.1%-1.5%和0.2%-6.9%。在最佳的分离条件下,可以将低分子量肝素样品中不同糖链长度的各个组份分离并对各个组份的分布进行了定量分析。用该方法对美国药标准品(USP)、商品和杭州九源基因有限公司制备的低分子量肝素糖链长度分布进行了定量对比。证明该方法可用于低分子量肝素类药物的组成成份的质量控制。3、本部分基于低分子量肝素各糖链组成成份分布的基础上,对每个色谱峰进行指认,制备低分子量肝素中糖链长度为十糖的化合物,经过除盐、纯化得到相对纯度较高的十糖。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章绪论  11-29
  1.1 前言  11
  1.2 肝素及低分子肝素的结构及功能  11-12
  1.3 肝素的理化性质  12-15
    1.3.1 物理性质  12-13
    1.3.2 化学性质  13
    1.3.3 低分子量肝素的药动力学  13-14
    1.3.4 低分子量肝素的药理作用  14-15
  1.4 低分子量肝素的制备  15-19
    1.4.1 化学解聚法  16-18
    1.4.2 肝素酶降解法  18-19
  1.5 肝素结构分析  19-23
    1.5.1 肝素中的单糖残基  20-21
    1.5.2 主要的二糖单元  21-22
    1.5.3 低硫酸化序列  22-23
  1.6 低分子量肝素分子量及抗凝效价的测定方法  23-26
    1.6.1 低分子量肝素分子量的测定方法  23-25
    1.6.2 肝素抗凝效价的测定  25-26
  1.7 本课题研究内容  26-27
  1.8 本课题的创新点和研究意义  27-29
第二章构成低分子量肝素特殊基团分析方法的建立  29-51
  2.1 引言  29-32
    2.1.1 低分子量肝素完全酶解生成1,6-脱水成环原理  29-30
    2.1.2 低分子量肝素完全酶解产物中低聚糖组分分析  30-32
    2.1.3 肝素酶的性质  32
  2.2 实验部分  32-35
    2.2.1 实验仪器  32-33
    2.2.2 实验试剂  33-34
    2.2.3 磷酸二氢钾pH 7.0溶液的配制  34
    2.2.4 肝素酶溶液的配制  34-35
    2.2.5 醋酸钠/醋酸钙pH 7.0缓冲液的配制  35
    2.2.6 样品的配制  35
    2.2.7 低分子量肝素完全酶解反应  35
    2.2.8 毛细管电泳条件  35
  2.3 结果与讨论  35-49
    2.3.1 低分子量肝素酶解时肝素酶(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)用量的研究  35-36
    2.3.2 低分子量肝素完全酶解时间的确定  36-38
    2.3.3 毛细管电泳法分离低分子量肝素完全酶解产物的色谱条件进一步优化  38-41
    2.3.4 低分子量肝素完全酶解生成1,6-成环率定量方法验证  41-44
    2.3.5 毛细管电泳法的重复性验证  44-48
    2.3.6 低分子量肝素完全酶解产物中△IS的标准曲线  48-49
  2.4 本章小结  49-51
第三章低分子量肝素体积排阻色谱法分离及组成成份定量分析研究  51-69
  3.1 引言  51-55
    3.1.1 低分子量肝素常用的分离方法及原理  52-55
  3.2 实验部分  55-57
    3.2.1 流动相的配制  55-56
    3.2.2 低分子量肝素样品的配制  56
    3.2.3 低分子量肝素各组成成份糖链分离建立的色谱条件  56-57
  3.3 结果与讨论  57-68
    3.3.1 分离模式的选择  57-59
    3.3.2 体积排阻色谱法固定相对低分子量肝素分离度的影响  59-61
    3.3.3 流动相的选择  61
    3.3.4 流动相的离子强度的影响  61-62
    3.3.5 流动相pH的优化  62
    3.3.6 流速对分离效果的影响  62-63
    3.3.7 柱温对分离的影响  63
    3.3.8 检测器的选择  63-64
    3.3.9 方法重复性验证  64-66
    3.3.10 方法应用  66-68
  3.4 本章小结  68-69
第四章十糖制备  69-74
  4.1 前言  69-71
  4.2 实验部分  71
    4.2.1 流动相的配制  71
    4.2.2 样品的配制  71
    4.2.3 低分子量肝素中十糖制备的色谱条件  71
  4.3 结果与讨论  71-73
    4.3.1 低分子量肝素中十糖制备  71-72
    4.3.2 去除制备十糖单元中的盐  72
    4.3.3 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪测定十糖单元结构  72-73
  4.4 本章小结  73-74
第五章结论  74-75
参考文献  75-79
发表论文  79-80
致谢  80

低分子量肝素精细结构的分析研究

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