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TrKB过表达与骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗的关系及对骨肉瘤生长和转移的影响

作　者: 曾静
导　师: 郭乔楠
学　校: 第三军医大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: TrKB 骨肉瘤失巢凋亡转移
分类号: R738
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

骨肉瘤是最常见的青少年骨原发恶性肿瘤之一,而骨肉瘤高发的肺转移率是影响其预后的主要因素,在临床做出骨肉瘤诊断时,已有80%的患者发生了肺转移1。近25年中,骨肉瘤的治疗有了长足的发展,近80%患者能保留患肢,且5年生存率由20%左右提高到近80%2,但仍有半数以上的骨肉瘤患者死于转移和复发。肿瘤转移包含了一系列复杂事件,如肿瘤细胞向周围组织浸润,侵入淋巴管或血管,经过脉管系统的运输,穿出脉管,在远处种植并形成转移灶3。肿瘤细胞要成功完成转移的这一系列步骤,必须获得一些基因型或表观遗传学的改变,例如,肿瘤细胞在脱离细胞间黏附及细胞外基质后获得的失巢凋亡抵抗(anoikis resistance)能力4。失巢凋亡抵抗被认为是转移一系列步骤中首要的关键步骤5-7。失巢凋亡(anoikis)是一种特殊的凋亡形式,指由于失去细胞与细胞或细胞与细胞外基质间接触而引起的凋亡8。正常的上皮细胞或不具备转移性质的肿瘤从原位脱落进入血流后就会发生细胞凋亡。失巢凋亡的意义在于防止这些脱落的细胞种植并生长于其他不适合的部位。而肿瘤细胞,尤其是一些容易发生远处转移的恶性肿瘤细胞,具有极强的失巢凋亡抵抗特性,从原发部位脱落进入循环系统后并不发生凋亡,从而完成转移过程。恶性肿瘤的这种失巢凋亡抵抗特性已经在肺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤中得到证实9-11。这种失巢凋亡抵抗现象不仅存在于上皮组织源性恶性肿瘤,也存在于肉瘤组织中。我们前期研究及国内外一些学者的研究表明,骨肉瘤也存在失巢凋亡抵抗现象12, 13。TrKB是一种神经营养因子酪氨酸激酶受体,和其配体BDNF结合,在神经系统的发育和功能发挥方面起着重要的作用14。然而,越来越多的研究证明,TrKB在抑制细胞失巢凋亡、促进肿瘤形成和转移等方面也有着重要意义。已有的研究发现TrKB在肝癌、肺癌、甲状腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤中表达普遍升高15-23,但TrKB是否与骨肉瘤失巢凋亡抵抗相关,其具体机制如何,目前尚缺乏相关研究。为此,本实验拟分四部分进行:第一部分用免疫组化技术检测人骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中TrKB表达水平,并用免疫荧光技术检测不同恶性程度的人骨肉瘤细胞系(包括低度恶性、无成瘤能力的SaOS-2骨肉瘤细胞系和本室建立的高度恶性、强成瘤、强转移能力的人永生化成骨细胞hFOB1.19恶性转化细胞,以下称MTF细胞)中TrKB的表达差异,目的在于探讨TrKB在骨肉瘤发生、转移中的意义。第二部分利用悬浮14d重贴壁的方法对MTF细胞和SaOS-2骨肉瘤细胞进行培养,流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测悬浮不同时间点的失巢凋亡率,并用MTT法、Transwell实验检测经过这种培养方法后细胞生物学特性(如增殖能力、迁移能力)的改变,目的在于探讨不同骨肉瘤细胞系失巢凋亡抵抗能力的差异性,建立人骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞模型,为进一步研究TrKB调控骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗的具体机制奠定基础。第三部分利用RT-PCR和Western-blot技术检测不同骨肉瘤细胞系及骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞中TrKB mRNA和蛋白表达水平,裸鼠成瘤实验检测骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞和不同骨肉瘤细胞系成瘤能力的差异,并用免疫组化方法检测瘤组织中TrKB的表达情况,目的在于明确TrKB过表达与骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗的关系及对骨肉瘤生长和转移的影响。第四部分用特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a阻断MTF细胞TrKB后,光镜观察分析阻断前后MTF细胞形态学改变,Transwell侵袭实验检测阻断前后MTF细胞侵袭能力改变,β-actin免疫荧光染色检测阻断前后MTF细胞微丝骨架的改变,目的在于探讨TrKB参与骨肉瘤细胞侵袭和转移的机制。主要的结果如下:1.免疫组化和免疫荧光化学检测显示:骨肉瘤组织中TrKB表达的阳性率为92.0% (46/50),显著高于骨软骨瘤组织的表达率5.9% (1/17), P < 0. 05。TrKB表达水平在不同骨肉瘤组织学分型、性别和年龄中的差异不显著,P >0.05,但骨肉瘤浸润边缘和复发病例中TrKB表达明显强于瘤体中央和原发病例。高度恶性、强致瘤、强转移能力的MTF细胞中TrKB的表达强度明显强于低度恶性、无致瘤能力的SaOS-2骨肉瘤细胞系,P < 0. 05。2.对MTF细胞和SaOS-2骨肉瘤细胞用悬浮14d再贴壁的方法进行培养, MTF细胞悬浮后凋亡出现快,在短时间内呈时间依赖性的凋亡率增高,但72h后,凋亡即进入稳态。而SaOS-2细胞凋亡率一直呈时间依赖性的升高。通过悬浮培养重贴壁的方法最终成功建立了MTF细胞失巢凋亡抵抗模型。3. MTT法检测细胞增殖能力显示,MTF失巢凋亡抵抗细胞(即anoikis-resistant MTF细胞,或称re-adherent MTF细胞)增殖能力比MTF细胞明显增强,而贴壁培养的SaOS-2细胞(或称adherent SaOS-2细胞)和悬浮14d重贴壁的SaOS-2细胞(或称re-adherent SaOS-2细胞)的增殖能力相比却无明显差异。4. Transwell迁移实验显示,平均每个视野的MTF细胞数为(3.6±6.3),而MTF失巢凋亡抵抗细胞为(62±15.9),P<0.05,表明MTF失巢凋亡抵抗细胞的迁移能力明显升高; Transwell小室下室中平均每个视野的adherent SaOS-2细胞数为(15.2±3.9),re-adherent SaOS-2细胞平均每个视野的细胞数为(15.2±6.9),P >0.05,迁移能力无明显差异。5. RT-PCR和Western-blot检测结果显示,在MTF细胞和MTF失巢凋亡抵抗细胞中,TrKB mRNA和蛋白表达均呈强阳性,且MTF失巢凋亡抵抗细胞中TrKB mRNA和蛋白表达水平明显升高;而adherent SaOS-2细胞和re-adherent SaOS-2细胞TrKB mRNA和蛋白表达水平均较低,且二者间无明显差异。6.裸鼠成瘤实验发现,MTF细胞和MTF失巢凋亡抵抗细胞均可成瘤,后者还可形成皮下转移。而adherent SaOS-2细胞和re-adherent SaOS-2细胞均不成瘤。7.免疫组织化学检测皮下原位瘤组织及转移瘤组织TrKB表达水平,结果显示TrKB表达水平为MTF失巢凋亡抵抗细胞形成的转移瘤组织>MTF失巢凋亡抵抗细胞形成的皮下原位瘤组织>MTF细胞形成的皮下原位瘤。8.用特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a处理MTF细胞,其细胞形态发生了明显改变。处理组MTF细胞变圆,贴壁24h时约2-15个细胞聚集成簇,单个细胞轮廓不清,细胞分界消失;非处理组MTF细胞呈多角形,贴壁24h时细胞分散生长,细胞间边界清晰,细胞间有较多突起连接。9. Transwell侵袭实验检测K252a处理组和非处理组MTF细胞侵袭力,结果显示K252a处理24h后,穿过ECM的细胞数,非处理组(76.29±14.61)明显高于K252a处理组(2.29±1.11),P < 0. 05。10. K252a处理组和非处理组MTF细胞β-actin免疫荧光染色显示,非处理组MTF细胞呈多角形,界限清晰,微丝较长,排列规则,细胞间有较多微丝相互交联。K252a处理组MTF细胞呈圆形,2-15个细胞聚集成簇,细胞间界限模糊或消失,甚至有胞核融合现象,微丝回缩变短,排列紊乱。主要的结论如下:1. TrKB过表达可能是骨肉瘤生物学行为评价的独立危险因素,并在骨肉瘤的发生、生长和转移过程中起着重要作用。2.不同的骨肉瘤细胞系失巢凋亡抵抗能力具有差异性,只有失巢凋亡抵抗能力强的骨肉瘤细胞系用悬浮培养重贴壁的方法才能够成功建立骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞模型。3.骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞增殖能力、迁移能力、裸鼠成瘤能力明显增强。4. TrKB表达水平越高,骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗能力越强;TrKB过表达可能通过抑制骨肉瘤细胞失巢凋亡促进骨肉瘤的生长和转移。5. TrKB可能通过对细胞骨架的调节作用参与骨肉瘤细胞的侵袭和转移,TrKB被阻断后通过改变细胞微丝骨架结构而降低细胞的体外侵袭力。

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