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嗜酸细胞瘤线粒体DNA D-loop区突变及其意义的初步探讨

作　者: 鄢丽敏
导　师: 宋文静
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 线粒体DNA D-loop区突变嗜酸细胞瘤意义石蜡标本
分类号: R737.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：1.福尔马林固定的石蜡包埋组织(paraffin embedded tissues PET)是临床病理诊断中使用最广、最易获得的标本,从中提取DNA一方面解决了病例来源少的困难,另一方面使基因检测结果与肿瘤的回顾性分析有效结合起来,便于分子生物学与临床医学的有机结合。本文比较分析从福尔马林固定的PET中提取DNA、并进行长片段PCR扩增的最佳方法和优化条件,以获取较高扩增率的中长片段的PCR产物。2.大量异常线粒体的存在使嗜酸细胞瘤成为研究线粒体DNA(mitochondrial DNA mtDNA)突变在肿瘤发生中作用的重要媒介,本文检测嗜酸细胞瘤中mtDNA D环(displacement loop D-loop)区的碱基突变情况,为进一步研究mtDNA在肿瘤发生中的作用提供依据,也在分子水平为嗜酸细胞瘤的诊断和鉴别诊断提供帮助。方法：1.选取天津医科大学附属总医院病理科1999年1月-2009年1月福尔马林固定、石蜡包埋的正常甲状腺组织20例,分别应用一步法、酚—氯仿抽提法、试剂盒法三种不同的方法提取总DNA,测定DNA的浓度和OD260/OD280比值,并分别采用传统PCR法和巢式PCR法对mtDNA D-loop区中一段长644bp的序列进行扩增,比较其成功扩增率；2.本实验的第一部分已成功摸索出从福尔马林固定的PET中提取DNA的最佳方法和优化条件,和以提取的DNA为模板进行长片段PCR扩增的方法。本部分收集天津医科大学附属总医院病理科1999年1月-2009年1月的14例甲状腺嗜酸细胞瘤和6例肾嗜酸细胞瘤的石蜡组织标本,分别提取瘤组织和瘤旁正常组织的总DNA。对mtDNA D-loop区(1122bp)进行PCR扩增,通过直接测序的方法对PCR产物的基因序列进行检测,探查其突变位点和多态性位点。结果：1.三种不同方法从福尔马林固定的PET中提取的DNA质量：酚—氯仿抽提法所得样本DNA的OD260/280比值最高,为1.703±0.086；一步法所得样本DNA的浓度最高,为23.456±1.854ng/μl；2.用传统PCR方法扩增长644bp的mtDNA D-loop区片段,一步法、酚—氯仿抽提法、试剂盒法提取DNA的扩增成功率分别为0%、5%、10%,仅极少样本扩增成功,条带浅,难以用于后续试验；而用巢式PCR的方法扩增同样的序列,扩增成功率分别为0%、95%、85%,阳性率明显提高,且条带清晰,测序峰图平稳；3.20例甲状腺、肾嗜酸细胞瘤及其正常组织标本中,共有7例(35%)肿瘤组织,1例(5%)正常组织检测到突变,两者之间差别有统计学意义(p<0.05,校正X2检验)；4.20例甲状腺、肾嗜酸细胞瘤及其正常组织标本中,共检出突变位点21个,突变发生率0.094%,突变主要集中在高变区Ⅰ(hypervariable segment HVⅠ) (np16024-np16383),占突变碱基数的94.12%,且均为异质性突变,其中除一个碱基缺失突变外均表现为碱基置换突变；5.甲状腺嗜酸细胞瘤和肾嗜酸细胞瘤之间突变情况未呈现明显差异；6.20例(100%)嗜酸细胞瘤标本中均检测出多态性位点,每例标本7-11个,共191个,发生率0.851%,多为同质性改变。且每例标本都检测出np73A-G、np146T-C、np150C-T、np263A-G、np303-309一个碱基C插入、np311-315一个碱基C插入、np16223C-T的多态性改变；7.20例嗜酸细胞瘤标本中,>50岁11例,≤50岁9例,男性6例,女性14例,瘤体直径≥3cm10例,<3cm10例,经统计分析发现：mtDNA D-loop区突变与患者的年龄、性别、肿瘤大小等参数均不存在关联性。结论：1.通过热激活,增加蛋白酶K浓度和蛋白酶K消化的作用时间,酚—氯仿纯化法从福尔马林固定的PET中提取的DNA质量可靠；巢式PCR技术是从PET中扩增长片段DNA产物的有效方法；2.通过对20例嗜酸细胞瘤mtDNA D-loop区测序比对,发现肿瘤组织突变率35%,而相应瘤旁正常组织只有5%,两者之间差别有显著统计学意义,提示mtDNA D-loop区突变与嗜酸细胞瘤异常线粒体的形成以及肿瘤的发生密切相关；3.突变主要集中在HVⅠ区,另外两个突变高发区HVⅡ和HVⅢ区未发生突变,说明HVⅠ区碱基突变在嗜酸细胞瘤的发生中可能发挥重要作用；4.本实验中所检测出的突变均为异质性突变,而多态性改变以同质性居多,进一步证实肿瘤的发生是以正常组织的同质状态向肿瘤组织的异质状态转变的[1].5. mtDNA D-loop区突变与患者的年龄、性别、肿瘤大小等参数均不存在关联性,提示mtDNA D-loop区变异不受性别、年龄等客观条件的影响,可能是肿瘤形成过程中的一个早期事件,并持续存在于肿瘤演变的全过程；6.本实验中,20例标本均存在np303-309区域1个碱基C插入的多态性改变,该区是mtDNA重链复制起始点,同时是线粒体转录因子A (mitochondrial translation factor A mtTFA)的结合位点,是高水平特异性转录起始所必须的,此处的突变可能会导致mtDNA转录的异常；7. D-loop区尤其是HVⅠ区是嗜酸细胞瘤的突变热点,由于D-loop区是mtDNA复制转录的调控区,这些位点上的变异可能会影响到mtDNA复制和转录的能力,导致mtDNA拷贝数和mtDNA编码基因的转录水平发生改变,通过与细胞核的相互作用,最终可能会对细胞的性质产生影响,对肿瘤的发生发展产生影响,也与线粒体功能异常密切相关；8. mtDNA序列具有种族和地域差异,单核苷酸多态性在不同种族间存在遗传差异,本实验中所检测的20例标本都含有np73A-G、np146T-C、np150C-T、np263A-G、np303-309C插入、np311-315C插入、np16225C-T的多态性改变,因此也为人种基因进化研究提供了宝贵的资料。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
符号说明  13-14
前言  14-17
  研究现状、成果  14-15
  研究目的、方法  15-17
一、石蜡包埋组织DNA提取方法的比较及巢式PCR技术的应用  17-28
  1.1 对象和方法  17-21
    1.1.1 组织标本  17
    1.1.2 实验试剂  17-18
    1.1.3 实验仪器  18
    1.1.4 缓冲液配置  18
    1.1.5 DNA的提取  18-20
      1.1.5.1 一步法  18-19
      1.1.5.2 酚/氯仿提纯法  19
      1.1.5.3 试剂盒法  19-20
    1.1.6 DNA纯度级产量测定  20
    1.1.7 PCR扩增  20-21
      1.1.7.1 引物  20
      1.1.7.2 反应体系  20
      1.1.7.3 反应条件  20-21
    1.1.8 PCR产物的鉴定、纯化及测序  21
    1.1.9 统计学方法  21
  1.2 结果  21-25
    1.2.1 各组标本OD260/280比值  21-22
    1.2.2 各组标本DNA浓度  22
    1.2.3 基因组DNA电泳图  22-23
    1.2.4 PCR扩增结果  23-25
  1.3 讨论  25-27
    1.3.1 实验结果  25
    1.3.2 PET组织DNA提取影响因素  25-26
    1.3.3 中长片段DNA扩增影响因素  26-27
  1.4 小结  27-28
    1.4.1 DNA提取  27
    1.4.2 DNA长片段扩增  27-28
二、嗜酸细胞瘤线粒体DNA D-loop区突变及其意义的初步探讨  28-44
  2.1 对象和方法  28-32
    2.1.1 组织标本  28
    2.1.2 实验试剂  28-29
    2.1.3 实验仪器  29
    2.1.4 缓冲液配置  29
    2.1.5 石蜡标本总DNA提取  29-30
    2.1.6 DNA质量检测  30-31
    2.1.7 PCR扩增mtDNA D-loop区  31
    2.1.8 PCR产物的鉴定、纯化及测序  31
    2.1.9 测序结果分析  31-32
    2.1.10 统计结果分析  32
  2.2 结果  32-39
    2.2.1 嗜酸细胞瘤病理组织观察  32-34
    2.2.2 DNA提取结果判定  34-35
    2.2.3 PCR扩增结果  35
    2.2.4 mtDNA测序结果分析  35-39
      2.2.4.1 碱基突变情况  35-36
      2.2.4.2 多态性改变  36-37
      2.2.4.3 mtDNA D-loop区突变与临床病理参数的关系  37-39
  2.3 讨论  39-43
    2.3.1 mtDNA介绍  39
    2.3.2 mtDNA突变热点  39-40
    2.3.3 mtDNA D-loop区突变意义  40-41
    2.3.4 mtDNA D-loop区突变与临床病理参数及预后的关系  41-42
    2.3.5 mtDNA与核DNA的相互作用  42
    2.3.6 关于mtDNA基因进化  42-43
  2.4 小结  43-44
结论  44-46
参考文献  46-52
发表论文和参加科研情况说明  52-53
综述  53-70
  线粒体DNA突变与肿瘤发生关系的研究进展  53-64
  综述参考文献  64-70
致谢  70

嗜酸细胞瘤线粒体DNA D-loop区突变及其意义的初步探讨

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