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蛛网膜下腔出血后脑血管核因子-κB激活及调控的相关研究

作　者: 印红霞
导　师: 刘新峰；史继新
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 蛛网膜下腔出血脑血管痉挛 NF-κB 氧合血红蛋白红细胞生成素
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH；下文SAH都特指自发性SAH)主要是由颅内动脉瘤破裂引起,是临床上较常见的致死、致残性疾病,占所有中风患者的5%左右,在普通人群中的发生率约为8／10万人。尽管近年来诊断水平、麻醉技术、手术及围手术期处理水平在不断提高,但SAH的预后仍未得到明显改观,数据显示SAH病人的死亡率在45%左右,而幸存者中大概三分之一左右生活不能自理,有较高的致残率。而致死、致残的主要原因除了SAH起病急骤等自身特点之外,临床上对其缺乏有效的治疗方法和手段也是影响本病转归的主要因素,而治疗手段的缺乏则要归咎于目前对于SAH病理生理机制认识的局限性。脑血管痉挛被认为是SAH患者死亡和残疾的主要原因。脑血管痉挛主要发生于破裂动脉瘤周围的大血管,可导致严重的、多灶性的脑缺血,从而造成不良的临床转归。虽然对脑血管痉挛的临床及基础研究很多,但至今脑血管痉挛仍是一种缺乏有效治疗的严重病理状态。越来越多的证据表明炎性反应是造成脑血管痉挛的一个重要机制,临床和实验研究都发现SAH后脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)及血清中细胞因子(cytokines)及内皮细胞粘附分子(endothelial adhesion molecules)水平明显升高。核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)是调节免疫炎性反应的快转录因子。NF-κB家族包括p50、RelA/p65、c-Rel、RelB和p52这5个亚单位,他们之间再组成二聚体以实现其功能。在静息状态下NF-κB位于细胞浆内,与其抑制蛋白IκB保持结合状态。NF-κB一旦被激活,就与IκB分离并转位入核,可以调控细胞因子、趋化分子(chemokines)和粘附分子等在炎性分子的转录。因此,很多与炎性相关的疾病都与NF-κB密切相关。现已证实,NF-κB在脑缺血(cerebral ischemia)及创伤性脑损伤(traumatic brain injury)中起着非常重要的作用。’因此,可以推断NF-κB在脑血管痉挛的发生、发展中或有着重要的作用,它可通过炎性反应引起脑血管痉挛或影响脑血管痉挛的程度,NF-κB或许是脑血管痉挛治疗中的一个潜在靶点。事实上,在SAH动物实验中已经证明NF-κB激活后通过调控炎性反应机制引起脑血管痉挛。但是在脑血管痉挛发生中起着极为重要作用的平滑肌细胞内,导致血管痉挛的氧合血红蛋白(oxyhemoglobin)对NF-κB的激活情况目前尚无系统研究,本研究的主要目的之一就是在体外探讨不同浓度氧合血红蛋白对培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells)内NF-κB激活的影响,以进一步揭示脑血管痉挛与平滑肌细胞内NF-κB关系的确切机制。此外,动物实验和临床研究均发现红细胞生成素(erythropoietin, EPO)可以有效的缓解脑血管痉挛,从而改善SAH患者的预后,但是对其治疗机制的认识,目前还非常有限。因此本研究结合前面的研究,对EPO治疗脑血管痉挛的作用再次在兔二次注血SAH模型中证实的前提下,通过观察其对NF-κB的调控作用,来阐明EPO对脑血管痉挛治疗的机制。因此,本研究主要是通过体外研究,证实氧合血红蛋白可激活培养的脑血管平滑肌细胞中的NF-κB这一假说。在此基础上,进一步研究目前临床上证实对脑血管痉挛有较好治疗作用的EPO对SAH后血管内NF-κB活性的调控以及与其治疗作用之间的关系。由此,也更进一步证实了NF-κB在脑血管痉挛中的重要作用。第一部分不同浓度氧合血红蛋白对体外培养脑血管平滑肌细胞NF-κB DNA结合活性的影响目的：通过体外实验,观察氧合血红蛋白对培养的脑血管平滑肌细胞密度及NF-κB激活的影响,以证实氧合血红蛋白可通过影响脑血管平滑肌细胞的形态并激活NF-κB而最终引起脑血管痉挛。方法：取兔基底动脉进行脑血管平滑肌细胞的原代培养并用α-actin的免疫组化进行平滑肌细胞鉴定。取该动物的自身的血液制作氧合血红蛋白。用不同浓度(1μmol/L-100μmol/L)的氧合血红蛋白处理培养的脑血管平滑肌细胞,观察其形态学及细胞密度变化,并通过测定NF-κB的DNA结合活性(凝胶电泳迁移分析法)评估NF-κB的激活情况。结果：氧合血红蛋白刺激后脑血管平滑肌细胞都表现出形态学的改变,主要表现为贴壁率下降,细胞坏死脱落增加,细胞分布较稀疏,部分细胞悬浮于培养液中,且随氧合血红蛋白浓度的增加而愈加严重。但是在24小时时只有100μmol/L组有明显的细胞数量减少(与对照组比较P<0.05),10μmol/L组在48小时时细胞数量开始明显较少(与对照组比较P<0.05)。平滑肌细胞的NF-κB的DNA结合活性在经氧合血红蛋白处理后(>10μmol/L)明显增高(与对照组比较P<0.05),不呈剂量依赖性,以10μmol/L及50μmol/L组为最高(与对照组相比P<0.01)。结论：NF-κB的DNA结合活性在经氧合血红蛋白处理的脑血管平滑肌细胞中有明显改变,证明了脑血管痉挛的主要致痉挛源氧合血红蛋白可以激活平滑肌细胞内的NF-κB,同时提示了NF-κB在CVS发生时是脑血管平滑肌细胞内重要的信号通路。第二部分EPO治疗兔SAH后脑血管痉挛及对脑血管NF-κB调控的实验研究目的：在兔SAH模型中验证EPO对迟发性脑血管痉挛的疗效,同时观察其对脑血管NF-κB激活情况的影响。方法取雄性新西兰白兔60只,随机分为对照组、SAH组和EPO治疗组,每组20只(n=20)。采用枕大池二次注血SAH模型诱发迟发性脑血管痉挛。EPO注射剂量为1000IU／kg,1次／8小时；对照组和SAH组均给予EPO的溶剂(含人血清蛋白2.5 mg/ml、氯化钠352mmol/L及蒸馏水),以1ml／kg经腹腔注射,连续腹腔注射15次。造模后第5天处死动物,取基底动脉,HE染色后测定基底动脉管腔横截面积,并用凝胶电泳迁移分析法检测NF-κB活性。结果①对照组、SAH组和EPO治疗组兔的基底动脉管腔截面积分别为(0.420±0.008)mm2、(0.225±0.025)mm2和(0.353±0.085)mm2。SAH组与对照组比较有统计学意义(P<0.01),说明模型制作成功、有效；EPO治疗组与SAH组比较也有统计学意义(P<0.01),说明EPO治疗可以缓解脑血管痉挛程度；EPO治疗组与对照组比较,仍有统计学意义(P<0.05),说明EPO治疗并不能完全缓解脑血管痉挛,EPO并不能对抗引起脑血管痉挛的全部机制,或者能够对这些机制都能完全逆转。②对照组、SAH组和EPO治疗组的NF-κB活性灰度值分别为：1.180±0.079、9.350±0.691和6.220±0.583,SAH组与对照组比较有统计学意义(P<0.01),再次表明SAH后脑血管NF-κB被激活；EPO治疗组与对照组、SAH组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),这说明了EPO可以抑制脑血管NF-κB的激活、调控其表达,但是因其并非NF-κB的特异性抑制剂,EPO并不能完全抑制SAH后NF-κB的激活。结论脑血管内的NF-κB在兔二次注血SAH模型中被激活；一定剂量的EPO治疗(1000IU／kg)可以部分抑制SAH后NF-κB的激活,并能通过调控该NF-κB的激活,从而缓解SAH后的迟发性脑血管痉挛。通过这两部分研究,首次系统的证实了作为主要致痉挛源的氧合血红蛋白,可以引起脑血管平滑肌细胞中表征NF-κB活性的NF-κB的DNA结合活性增高。表示氧合血红蛋白可以激活平滑肌细胞内的NF-κB,使其活性增高。而通过EPO在动物SAH模型内下调SAH后的NF-κB活性后发现脑血管痉挛也能明显减轻,这也进一步证实了NF-κB在脑血管痉挛中的作用,同时也再次证实了EPO对脑血管痉挛的治疗作用,从炎性反应及其上游调控因子NF-κB这一方面揭示了EPO治疗脑血管痉挛的机制。这将为今后在体外平滑肌细胞中研究氧合血红蛋白通过影响何种方式、何种因子激活NF-κB从而引起脑血管痉挛以及EPO通过那种具体的方式抑制NF-κB从而减轻脑血管痉挛等研究提供了依据。

全文目录

摘要  2-7
ABSTRACT  7-15
第一部分  15-30
  前言  15-16
  第一章材料与方法  16-19
    1.1 实验设计  16
    1.2 药品及试剂  16-17
    1.3 仪器设备  17
    1.4 实验方法  17-19
      1.4.1 氧合血红蛋白的制备  17
      1.4.2 兔基底动脉平滑肌细胞分离及培养  17-18
      1.4.3 实验分组  18
      1.4.4 细胞密度分析  18-19
      1.4.5 NF-κB的DNA结合活性测定  19
    1.5 统计学分析  19
  第二章结果  19-26
    2.1 氧合血红蛋白制备  19
    2.2 氧合血红蛋白处理后脑血管平滑肌细胞的形态学改变  19-20
    2.3 细胞密度分析  20-23
    2.4 NF-κB的DNA结合活性  23-26
  第三章讨论  26-28
  参考文献  28-30
第二部分  30-43
  前言  30
  第一章材料与方法  30-34
    1.1 动物与分组  30-31
    1.2 药品及试剂  31
    1.3 仪器设备  31
    1.4 实验方法  31-33
      1.4.1 SAH模型的建立  31-32
      1.4.2 用药方法  32
      1.4.3 动物处死和取材  32
      1.4.4 基底动脉横截面积的计算  32-33
      1.4.5 凝胶电泳迁移分析法检测NF-κB活性  33
    1.5 统计学分析  33-34
  第二章结果  34-39
    2.1 动物行为  34
    2.2 基底动脉HE染色及横截面积测定  34-37
    2.3 EMSA测定NF-κB活性  37-39
  第三章讨论  39-43
    3.1 EPO对SAH后脑血管痉挛作用  39-40
    3.2 炎性反应因子与SAH后脑血管痉挛  40
    3.3 EPO抑制NF-κB的表达  40-41
    3.4 EPO在SAH后的神经保护作用  41
    3.5 小结  41-43
参考文献  43-46
全文小结  46-47
综述  47-54
附录  54-55
攻读学位期间成果  55-56
致谢  56-57

蛛网膜下腔出血后脑血管核因子-κB激活及调控的相关研究

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